Olink NextSeq 2000 Raziščite sistem zaporedja

Opomba dokumenta

Uporabniški priročnik Olink® Explore, dokument št. 1153, je zastarel in so ga nadomestili naslednji dokumenti:

• Olink® Explore Overview Uporabniški priročnik, dokument št. 1187
• Uporabniški priročnik za Olink® Explore 384, dokument št. 1188
• Uporabniški priročnik Olink® Explore 4 x 384, dokument št. 1189
• Uporabniški priročnik za Olink® Explore 1536 & Expansion, dokument št. 1190
• Uporabniški priročnik za Olink® Explore 3072, dokument št. 1191
• Olink® Raziščite zaporedje z uporabniškim priročnikom NextSeq 550, dokument št. 1192
• Olink® Raziščite zaporedje z uporabniškim priročnikom NextSeq 2000, dokument št. 1193
• Olink® Raziščite zaporedje z uporabniškim priročnikom NovaSeq 6000, dokument št. 1194

Uvod

Namen uporabe

Olink® Explore je platforma za multipleksne imunske teste za odkrivanje biomarkerjev človeških beljakovin. Izdelek je namenjen samo za raziskovalno uporabo in ne za uporabo v diagnostičnih postopkih. Laboratorijsko delo lahko vodi samo usposobljeno laboratorijsko osebje. Obdelavo podatkov lahko izvaja samo usposobljeno osebje. Rezultate naj bi raziskovalci uporabljali v povezavi z drugimi kliničnimi ali laboratorijskimi izvidi.

O tem priročniku

Ta uporabniški priročnik vsebuje navodila, potrebna za zaporedje knjižnic Olink® Explore na Illumina® NextSeq™ 2000. Navodila je treba dosledno in izrecno upoštevati. Kakršna koli odstopanja med laboratorijskimi koraki lahko povzročijo oslabljene podatke. Pred začetkom laboratorijskega dela se posvetujte z Olink® Explore Overview Uporabniški priročnik za uvod v platformo, vključno z informacijami o reagentih, potrebni opremi in dokumentaciji, overview poteka dela, kot tudi laboratorijske smernice. Za navodila o tem, kako zagnati komplete reagentov Olink® Explore, glejte ustrezni uporabniški priročnik Olink® Explore. Za obdelavo podatkov in analizo rezultatov zaporedja Olink® Explore glejte Uporabniški priročnik za Olink® MyData Cloud. Vse blagovne znamke in avtorske pravice v tem gradivu so last Olink® Proteomics AB, razen če je navedeno drugače.

Tehnična podpora

Za tehnično podporo se obrnite na Olink Proteomics na: support@olink.com.

Laboratorijska navodila

V tem poglavju so navodila za določanje zaporedja knjižnic Olink na NextSeq™ 2000 z uporabo reagentov NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciklov) v3. Protokol, uporabljen za sekvenciranje, je prilagoditev standardnega poteka dela Illumina® NGS za Illumina® NextSeq™ 2000. Preden nadaljujete s sekvenciranjem, se prepričajte, da je bila preverjena kakovost prečiščene knjižnice Olink. Za navodila o nadzoru kakovosti glejte ustrezni uporabniški priročnik Olink Explore.

Načrtujte zaporedje

Eno knjižnico Olink lahko sekvencirate na pretočno celico NextSeq™ 2000 P2 in na zagon. Število pretočnih celic P2 in postopkov, potrebnih za zaporedje različnih kompletov reagentov Olink Explore, je opisano v tabeli 1. Če je potrebnih več kot en postopek, ponovite navodila, opisana v tem priročniku.

Tabela 1. Načrtovanje zaporedja

Komplet reagentov Olink® Explore	Število knjižnic Olink	Število pretočnih celic in ciklusov
Komplet reagentov Olink® Explore 384	1	1
Komplet reagentov Olink® Explore 4 x 384	4	4
Komplet reagentov Olink® Explore 1536	4	4
Komplet reagentov za razširitev Olink® Explore	4	4
Komplet reagentov Olink® Explore 3072	8	8

Namestite Olink® recept po meri

Shranite recept po meri Olink xml-file Olink_NSQ2K_P2_V1 v ustrezni mapi instrumenta.

OPOMBA: Recept po meri Olink bo deloval samo s kompletom reagentov NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciklov) v3 in nadzorno programsko opremo NextSeq™ 1000/2000 v1.2 ali v1.4.

Pripravite reagente za sekvenciranje

Med tem korakom se reagentna kartuša, ki vsebuje reagente za združevanje in sekvenciranje, odmrzne in pripravi pretočno celico.

OPOZORILO: Kartuša z reagentom vsebuje potencialno nevarne kemikalije. Nosite ustrezno zaščitno opremo in zavrzite uporabljene reagente v skladu z veljavnimi standardi. Za več informacij glejte sistemski priročnik Illumina NextSeq 1000 in 2000 (dokument št. 1000000109376).

Pripravite kartušo z reagentom

Neodprto kartušo lahko odtajate na tri različne načine: pri sobni temperaturi, v nadzorovani vodni kopeli ali v hladilniku.

Pripravite klop

• 1x NextSeq™ 1000/2000 P2 reagentna kartuša (100 ciklov)

Navodila

1. Odmrznite kartušo z reagentom, kot je opisano v tabeli 2.

Tabela 2. Metode odmrzovanja vložka z reagentom

Metoda odmrzovanja	Navodila
Pri sobni temperaturi	Ne da bi odprli vrečko iz srebrne folije, položite zamrznjeno kartušo z reagentom na mizo in jo odtajajte pri sobni temperaturi 9 ur. Ne prekoračite 16 ur. Prepričajte se, da je nalepka vrečke obrnjena navzgor in da lahko zrak kroži okoli kartuše.
V vodni kopeli	Ne da bi odprli vrečko iz srebrne folije, zamrznjeno kartušo z reagentom postavite napol potopljeno v nadzorovano vodno kopel pri 25 °C in pustite, da se odmrzne 6 ur. Ne prekoračite 8 ur. Prepričajte se, da je nalepka vrečke obrnjena navzgor in da se kartuša med odmrzovanjem ne obrne. Kartušo temeljito osušite s papirnato brisačo.
V hladilniku	Ne da bi odprli vrečko iz srebrne folije, položite kartušo na mizo in jo odmrzujte pri sobni temperaturi 6 ur. Prepričajte se, da je nalepka vrečke obrnjena navzgor in da lahko zrak kroži okoli kartuše. Vložek zaključite z odmrzovanjem v hladilniku za 12 ur. Ne prekoračite 72 ur. Pred tekom odstranite odmrznjeno neodprto kartušo iz hladilnika in pustite, da doseže sobno temperaturo vsaj 15 minut, vendar ne več kot 1 uro.

OPOMBA: Odmrznjenih vložkov ni mogoče ponovno zamrzniti in jih je treba hraniti pri 4 °C največ 72 ur.

Pripravite pretočno celico

Pripravite klop

• 1x pretočna celica NextSeq™ 1000/2000 P2

Navodila

1. Ohlajeno pretočno celico segrejte na sobno temperaturo za 10-15 minut.

Pripravite knjižnico Olink® za sekvenciranje

Med tem korakom se prečiščena in kakovostno nadzorovana knjižnica Olink razredči do končne koncentracije nalaganja. Upoštevajte, da se denaturacija knjižnice izvede samodejno na instrumentu.

Pripravite klop

• Lib Tube, pripravljen v skladu z veljavnim uporabniškim priročnikom Olink Explore
• 1x RSB s Tween 20
• Voda MilliQ
• 2x mikrocentrifugalne epruvete (1.5 ml)
• Ročna pipeta (10, 100 in 1000 μL)
• Konice pipete za filter

Preden začnete

• Odtajajte cev Lib, če je zamrznjena.
• Zamrznjeni RSB odmrznite s Tween 20 pri sobni temperaturi 10 minut. Do uporabe hraniti pri +4 °C.
• Označite dve novi 1.5 ml mikrocentrifugalni epruveti na naslednji način:
  • Eno epruveto označite z "Dil" (za 1:100 razredčeno knjižnico)
  • Označite eno epruveto z »Seq« (za knjižnico, pripravljeno za nalaganje)

Navodila

1. Dodajte 495 μL vode MilliQ v Dil Tube.
2. Vortex Lib Tube in ga na kratko zavrtite navzdol.
3. Ročno prenesite 5 μL iz epruvete Lib v epruveto Dil.
4. Vortex Dil Tube in ga na kratko zavrtite navzdol.
5. Dodajte 20 μL RBS s Tween 20 v Seq Tube.
6. Ročno prenesite 20 μL iz epruvete Dil v epruveto Seq.
7. Vortexajte Seq Tube in ga na kratko zavrtite.
8. Takoj nadaljujte z 2.5. Nalaganje pretočne celice in knjižnice Olink® v reagentno kartušo.

OPOMBA: Epruvete Lib shranite pri -20 °C v primeru morebitne ponovne izvedbe.

Naložite pretočno celico in knjižnico Olink® v reagentno kartušo

Med tem korakom se pretočna celica in razredčena knjižnica Olink naložita v kartušo z odmrznjenim reagentom.

Pripravite klop

• 1x odmrznjen reagentni vložek NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciklov), pripravljen v prejšnjem koraku
• 1x pretočna celica NextSeq™ 1000/2000 P2, pripravljena v prejšnjem koraku
• Seq Tube (s pripravljeno za nalaganje razredčene knjižnice Olink), pripravljeno v prejšnjem koraku
• Ročna pipeta (100 μL)
• Konica pipete (1 ml)

Pripravite kartušo

1. Odstranite kartušo iz vrečke iz srebrne folije.
2. Kartušo desetkrat obrnite, da temeljito premešate odmrznjene reagente v njej.

OPOMBA: Običajno je slišati žvenketanje notranjih komponent.

Naložite pretočno celico v kartušo

1. Ko ste pripravljeni naložiti pretočno celico v kartušo, jo odstranite iz embalaže. Pretočno celico primite za sivi jeziček, tako da je nalepka na jezičku obrnjena navzgor. Uporabite nove rokavice brez pudra, da preprečite kontaminacijo steklene površine pretočne celice.
2. Vstavite pretočno celico v režo za pretočno celico na sprednji strani kartuše. Slišen klik pomeni, da je pretočna celica pravilno nameščena.
3. Odstranite sivi jeziček tako, da ga izvlečete.

Naložite knjižnico Olink® Library v kartušo

1. Preluknjajte rezervoar Library s čisto konico 1 ml pipete.
2. Naložite 20 μL knjižnice Olink iz epruvete Seq na dno rezervoarja knjižnice.

Izvedite zaporedje Olink®

Med tem korakom se puferski vložek z naloženo pretočno celico in knjižnico Olink naloži v NextSeq™ 2000 in zažene se sekvenciranje z uporabo recepta Olink.

Pripravite klop

• 1x reagentna kartuša NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciklov), naložena s pretočno celico NextSeq™ 1000/2000 P2 in razredčeno knjižnico Olink, pripravljeno v prejšnjem koraku.

Konfigurirajte način izvajanja

1. V meniju nadzorne programske opreme izberite Nastavitve.
2. Pod BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support izberite Local Run Setup.
3. Kot dodatne nastavitve izberite Samo proaktivna podpora. Ta funkcija zahteva internetno povezavo.
4. Izberite lokacijo gostovanja za svoje podatke. Lokacija gostovanja mora biti v vaši regiji ali blizu nje.
5. Nastavite lokacijo izhodne mape za trenutne neobdelane podatke. Izberite Izberite za navigacijo in izberite izhodno mapo.
6. Izberite potrditveno polje Denature and Dilute On Board, da samodejno denaturirate in razredčite knjižnico v instrumentu.
7. Izberite potrditveno polje Purge Reagent Cartridge, če želite samodejno odstraniti neuporabljene reagente v predel za porabljene reagente v kartuši.
8. Izberite potrditveno polje Samodejno preverjanje posodobitev programske opreme za samodejno preverjanje posodobitev programske opreme (izbirno). Ta funkcija zahteva internetno povezavo.
9. Izberite Shrani.

Nastavite parametre delovanja

OPOMBA: To navodilo velja za različico 1.4 nadzorne programske opreme NextSeq™ 1000/2000. Nekateri spodaj opisani koraki so lahko drugačni pri uporabi različice v1.2

1. V meniju nadzorne programske opreme izberite Start.
2. Izberite Manually Set Up New Run in pritisnite Setup.
3. Na strani Run Setup nastavite parametre izvajanja na naslednji način:
   • V polje Ime izvajanja vnesite enolični ID poskusa.
   • Na spustnem seznamu Vrsta branja izberite možnost Eno branje.
   • Vnesite število ciklov, kot sledi:
     • Preberi 1: 24
     • Indeks 1: 0
     • Indeks 2: 0
     • Preberi 2: 0

OPOMBA: Bistveno je, da je branje 1 nastavljeno na 24, sicer bo celoten zagon neuspešen. Pri vnosu števila ciklov ne upoštevajte opozoril.

• Na spustnem seznamu Custom Primer Wells izberite Ne.
• V polju Recept po meri (neobvezno) izberite Izberi za navigacijo in izberite XML recepta po meri file Olink_NSQ2K_P2_V1. Izberite Odpri.
• Ne uvažajte Sample List.
• Prepričajte se, da je lokacija izhodne mape pravilna. V nasprotnem primeru izberite Izberi za navigacijo in izberite želeno lokacijo izhodne mape.
• V polju Denature and Dilute Onboard izberite Enabled s spustnega seznama.
• Izberite Prep.

Napolnite napolnjeno kartušo

1. Izberite Naloži. Vizir instrumenta se odpre in pladenj se izvrže.
2. Naloženo kartušo položite na pladenj z nalepko obrnjeno navzgor in pretočno celico v instrument.
3. Izberite Zapri.
4. Ko je kartuša pravilno naložena, preverite parametre delovanja in izberite Zaporedje. Instrument izvaja preverjanja instrumenta in tekočine pred zagonom.
   • OPOMBA: Med preverjanjem tekočine se pričakuje, da bo slišati več pokajočih zvokov.
5. Prepričajte se, da se postopek začne po zaključku samodejnih preverjanj pred začetkom (približno 15 minut). Čas delovanja sekvenciranja je približno 10h30 min.
   • OPOMBA: Za morebitne napake pri preverjanju pred zagonom glejte navodila proizvajalca. Pazite, da se med postopkom sekvenciranja ne zaletite v NextSeq™ 2000 ali ga kako drugače motite. Instrument je občutljiv na tresljaje.
6. Očistite delovno območje.

Spremljajte napredek teka

Olink uporablja NGS kot odčitek za količinsko opredelitev količine znanega zaporedja, da oceni koncentracijo danega proteina v samples (v primerjavi z drugimi samples). Kakovost podatkov iz vsakega zagona sekvenciranja Explore v glavnem določajo parametri QC, ki so edinstveni za tehnologijo Olink. Zato so standardne metrike nadzora kakovosti, ki se uporabljajo v običajnih NGS, kot je Q-score, manj kritične.

Po koncu postopka izvrzite in zavrzite kartušo

OPOZORILO: Ta komplet reagentov vsebuje potencialno nevarne kemikalije. Nosite ustrezno zaščitno opremo in zavrzite uporabljene reagente v skladu z veljavnimi standardi. Za več informacij glejte sistemski priročnik Illumina NextSeq 1000 in 2000 (dokument št. 1000000109376).

1. Ko je postopek končan, izberite Izvrzi kartušo.
   • OPOMBA: Uporabljeno kartušo, vključno s pretočno celico, lahko pustite na mestu do naslednjega zagona, vendar ne več kot 3 dni.
2. Odstranite kartušo iz pladnja.
3. Reagente zavrzite v skladu z veljavnimi standardi.
4. Izberite Zapri vrata. Pladenj je ponovno naložen.
5. Izberite Domov, da se vrnete na začetni zaslon.
   • OPOMBA: Ker kartuša vsebuje vse mehanizme za zagon sistema, kot tudi rezervoar za zbiranje uporabljenih reagentov, ni potrebe po pranju instrumenta po zagonu.

Zgodovina revizij

Različica	Datum	Opis
1.0	2021-12-01	Novo

www.olink.com

Samo za raziskovalno uporabo. Ni za uporabo v diagnostičnih postopkih.

Ta izdelek vključuje licenco za nekomercialno uporabo izdelkov Olink. Komercialni uporabniki lahko zahtevajo dodatne licence. Za podrobnosti se obrnite na Olink Proteomics AB. Ni nobenih jamstev, izrecnih ali implicitnih, ki presegajo ta opis. Olink Proteomics AB ni odgovoren za materialno škodo, telesne poškodbe ali gospodarsko škodo, ki jo povzroči ta izdelek. Naslednja blagovna znamka je v lasti Olink Proteomics AB: Olink®. Ta izdelek je zajet v številnih patentih in patentnih prijavah, ki so na voljo na https://www.olink.com/patents/.

© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Vse blagovne znamke tretjih oseb so last njihovih lastnikov.

Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B, SE-752 37 Uppsala, Švedska

1193, v1.0, 2021-12-01

Dokumenti / Viri

Olink NextSeq 2000 Raziščite sistem zaporedja [pdfUporabniški priročnik NextSeq 2000, Raziščite sistem zaporedja, NextSeq 2000 Raziščite sistem zaporedja

Reference

• Uporabniški priročnik