Olink NextSeq 2000 Explore o sistema de secuenciación
Nota do documento
O manual de usuario de Olink® Explore, doc nº 1153, está obsoleto e foi substituído polos seguintes documentos:
- Olink® Explore Overview Manual de usuario, doc nr 1187
- Manual de usuario de Olink® Explore 384, doc nr 1188
- Olink® Explore 4 x 384 User Manual, doc nr 1189
- Olink® Explore 1536 & Expansion User Manual, doc nr 1190
- Manual de usuario de Olink® Explore 3072, doc nr 1191
- Olink® Explore Sequencing usando NextSeq 550 User Manual, doc nr 1192
- Olink® Explore Sequencing usando NextSeq 2000 User Manual, doc nr 1193
- Olink® Explore Sequencing usando NovaSeq 6000 User Manual, doc nr 1194
Introdución
Uso previsto
Olink® Explore é unha plataforma de inmunoensaio múltiple para o descubrimento de biomarcadores de proteínas humanas. O produto está destinado só para uso de investigación, e non para uso en procedementos de diagnóstico. O traballo de laboratorio só será realizado por persoal de laboratorio capacitado. O tratamento dos datos só será realizado por persoal capacitado. Os resultados están destinados a ser utilizados polos investigadores en conxunto con outros achados clínicos ou de laboratorio.
Sobre este manual
Este manual de usuario proporciona as instrucións necesarias para secuenciar as bibliotecas Olink® Explore en Illumina® NextSeq™ 2000. As instrucións deben seguirse de forma estrita e explícita. Calquera desviación ao longo dos pasos do laboratorio pode producir datos deteriorados. Antes de iniciar o fluxo de traballo do laboratorio, consulte o Olink® Explore Overview Manual de usuario para unha introdución á plataforma, incluíndo información sobre reactivos, equipos e documentación necesaria, e máisview do fluxo de traballo, así como as directrices do laboratorio. Para obter instrucións sobre como executar os kits de reactivos Olink® Explore, consulte o Manual de usuario de Olink® Explore aplicable. Para o procesamento de datos e a análise dos resultados da secuencia de Olink® Explore, consulte a Guía de usuario de Olink® MyData Cloud. Todas as marcas comerciais e dereitos de autor contidos neste material son propiedade de Olink® Proteomics AB, a non ser que se indique o contrario.
Soporte técnico
Para soporte técnico, póñase en contacto con Olink Proteomics en: support@olink.com.
Instrucións de laboratorio
Este capítulo ofrece instrucións sobre como secuenciar bibliotecas Olink en NextSeq™ 2000 usando os reactivos NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos) v3. O protocolo utilizado para a secuenciación é unha adaptación do fluxo de traballo NGS estándar de Illumina® para Illumina® NextSeq™ 2000. Antes de proceder á secuencia, asegúrese de que se verificou a calidade da biblioteca Olink purificada. Consulte o Manual de usuario de Olink Explore aplicable para obter instrucións sobre o control de calidade.
Planificar a secuenciación
Pódese secuenciar unha biblioteca Olink por célula de fluxo NextSeq™ 2000 P2 e por carreira. Na Táboa 2 descríbese o número de celas de fluxo P1 e series necesarias para secuenciar os diferentes kits de reactivos Olink Explore. Se se precisa máis dunha carreira, repita as instrucións descritas neste manual.
Táboa 1. Planificación de carreiras de secuenciación
| Kit de reactivos Olink® Explore | Número de bibliotecas Olink | Número de cela(s) de fluxo e carreira(s) |
| Kit de reactivos Olink® Explore 384 | 1 | 1 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 4 x 384 | 4 | 4 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 1536 | 4 | 4 |
| Kit de reactivos de expansión Olink® Explore | 4 | 4 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 3072 | 8 | 8 |
Instala a receita personalizada Olink®
Garda a receita personalizada de Olink xml-file Olink_NSQ2K_P2_V1 nun cartafol de instrumentos axeitado.
NOTA: A receita personalizada de Olink só funcionará co kit NextSeq™ 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 e co software de control NextSeq™ 1000/2000 v1.2 ou v1.4.
Preparar reactivos de secuenciación
Durante este paso, descongélase o cartucho de reactivos que contén os reactivos de agrupación e secuenciación e prepárase a célula de fluxo.
AVISO: O cartucho de reactivos contén produtos químicos potencialmente perigosos. Use o equipo de protección adecuado e descarte os reactivos usados de acordo coas normas aplicables. Para obter máis información, consulte a Guía do sistema Illumina NextSeq 1000 e 2000 (documento #1000000109376).
Prepare o cartucho de reactivos
Desconxelar o cartucho sen abrir pódese facer mediante tres métodos diferentes: a temperatura ambiente, nun baño de auga controlado ou na neveira.
Prepara o banco
- 1 cartucho de reactivo NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos)
Instrucións
- Desconxelar o cartucho de reactivo segundo se describe na táboa 2.
Táboa 2. Métodos de desconxelación dos cartuchos de reactivos
| Método de desconxelación | Instrucións |
| A temperatura ambiente |
|
| Nun baño de auga |
|
| Na neveira |
|
NOTA: Os cartuchos desconxelados non se poden volver conxelar e deben almacenarse a 4 °C, durante un tempo máximo de 72 horas.
Preparar a célula de fluxo
Prepara o banco
- 1x célula de fluxo NextSeq™ 1000/2000 P2
Instrucións
- Leve a célula de fluxo refrixerada a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
Prepare a biblioteca Olink® para a secuenciación
Durante este paso, a biblioteca Olink purificada e controlada de calidade dilúese ata a concentración de carga final. Teña en conta que a desnaturalización da biblioteca realízase automaticamente a bordo do instrumento.
Prepara o banco
- Lib Tube, preparado segundo o Manual de usuario de Olink Explore aplicable
- 1x RSB con Tween 20
- Auga MilliQ
- 2x tubos de microcentrífuga (1.5 ml)
- Pipeta manual (10, 100 e 1000 μL)
- Puntas de pipeta con filtro
Antes de comezar
- Desconxelar o tubo Lib se está conxelado.
- Desconxelar o RSB conxelado con Tween 20 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Almacenar a +4 °C ata o seu uso.
- Marque os dous novos tubos de microcentrífuga de 1.5 ml do seguinte xeito:
- Marque un tubo como "Dil" (para a biblioteca diluída 1:100)
- Marque un tubo como "Seq" (para a biblioteca lista para cargar)
Instrucións
- Engade 495 μL de auga MilliQ ao tubo Dil.
- Agitar o tubo Lib e xiralo brevemente.
- Transfire manualmente 5 μL do tubo Lib ao tubo Dil.
- Agitar o tubo Dil e xiralo brevemente.
- Engade 20 μl de RBS con Tween 20 ao tubo Seq.
- Transfire manualmente 20 μl do tubo Dil ao tubo Seq.
- Agitar o Seq Tube e xiralo brevemente.
- Continúe inmediatamente a 2.5 Cargue a célula de fluxo e a biblioteca Olink® no cartucho de reactivos.
NOTA: Almacene o(s) tubo(s) Lib a -20 °C en caso de posibles repeticións.
Cargue a célula de fluxo e a biblioteca Olink® no cartucho de reactivos
Durante este paso, a célula de fluxo e a biblioteca Olink diluída cárganse no cartucho de reactivo desconxelado.
Prepara o banco
- 1 cartucho de reactivos NextSeq™ 1000/2000 P2 descongelado (100 ciclos), preparado no paso anterior
- 1x NextSeq™ 1000/2000 P2 Flow Cell, preparada no paso anterior
- Seq Tube (con biblioteca Olink diluída lista para cargar), preparado no paso anterior
- Pipeta manual (100 μl)
- Punta de pipeta (1 ml)
Prepare o cartucho
- Retire o cartucho da bolsa de folla de prata.
- Inverte o cartucho dez veces para mesturar ben os reactivos descongelados.
NOTA: É normal escoitar os compoñentes internos tintinear.
Cargue a cela de fluxo no cartucho
- Cando estea listo para cargar a célula de fluxo no cartucho, retire a célula de fluxo do paquete. Suxeita a cela de fluxo pola pestana gris, coa etiqueta da pestana cara arriba. Use luvas novas sen po para evitar contaminar a superficie de vidro da célula de fluxo.
- Insira a célula de fluxo na ranura da célula de fluxo situada na parte frontal do cartucho. Un clic audible indica que a célula de fluxo está colocada correctamente.
- Retire a pestana gris tirando dela.
Cargue a biblioteca Olink® no cartucho
- Perfore o depósito da biblioteca cunha punta de pipeta limpa de 1 ml.
- Cargue 20 μL da biblioteca Olink do tubo Seq no fondo do depósito da biblioteca.
Realice a execución de secuenciación Olink®
Durante este paso, o cartucho de tampón coa célula de fluxo cargada e a biblioteca Olink cárgase no NextSeq™ 2000 e iníciase a execución de secuenciación usando a receita Olink.
Prepara o banco
- 1 cartucho de reactivo NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos) cargado coa célula de fluxo NextSeq™ 1000/2000 P2 e a biblioteca Olink diluída, preparada no paso anterior.
Configure o modo de execución
- No menú do software de control, seleccione Configuración.
- En BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support, seleccione Local Run Setup.
- Seleccione Soporte proactivo só como opcións adicionais. Esta función require unha conexión a Internet.
- Seleccione a localización de hospedaxe para os seus datos. A localización de hospedaxe debe estar na túa rexión ou preto da mesma.
- Estableza a localización do cartafol de saída para os datos en bruto da execución actual. Seleccione Escoller para navegar e seleccione o cartafol de saída.
- Seleccione a caixa de verificación Desnaturalizar e diluír a bordo para desnaturalizar e diluír automaticamente a biblioteca a bordo do instrumento.
- Seleccione a caixa de verificación Purgar cartucho de reactivos para purgar automaticamente os reactivos non utilizados no compartimento de reactivos gastados do cartucho.
- Seleccione a caixa de verificación Autocomprobación de actualizacións de software para comprobar automaticamente as actualizacións de software (opcional). Esta función require unha conexión a Internet.
- Seleccione Gardar.
Configurar os parámetros de execución
NOTA: Esta instrución aplícase á versión 1.4 do software de control NextSeq™ 1000/2000. Algúns dos pasos descritos a continuación poden ser diferentes cando se usa a versión v1.2
- No menú do software de control, seleccione Inicio.
- Seleccione Configurar manualmente a nova carreira e prema Configuración.
- Na páxina de configuración de execución, configure os parámetros de execución do seguinte xeito:
- No campo Nome da execución, introduza un ID de experimento único.
- Na lista despregable Tipo de lectura, seleccione a opción Lectura única.
- Introduza o número de ciclos do seguinte xeito:
- Ler 1: 24
- Índice 1: 0
- Índice 2: 0
- Ler 2: 0
NOTA: É fundamental que Read 1 estea configurado en 24, se non, fallará toda a execución. Ignora as mensaxes de aviso ao introducir o número de ciclos.
- Na lista despregable Custom Primer Wells, seleccione Non.
- No campo Receita personalizada (opcional), seleccione Escolla para navegar e seleccione o XML de receita personalizada file Olink_NSQ2K_P2_V1. Seleccione Abrir.
- Non importe un Sample Folla.
- Asegúrese de que a localización do cartafol de saída é correcta. En caso contrario, seleccione Escolla para navegar e seleccione a localización do cartafol de saída desexada.
- No campo Desnaturalizar e diluír a bordo, seleccione Activado na lista despregable.
- Seleccione Prep.
Cargue o cartucho cargado
- Seleccione Cargar. A pantalla do instrumento ábrese e a bandexa é expulsada.
- Coloque o cartucho cargado na bandexa coa etiqueta cara arriba e a célula de fluxo dentro do instrumento.
- Seleccione Pechar.
- Unha vez que o cartucho estea cargado correctamente, verifique os parámetros de execución e seleccione Secuencia. O instrumento realiza comprobacións previas ao funcionamento do instrumento e dos fluidos.
- NOTA: Durante a comprobación de fluídas, espérase que escoite varios sons de estalido.
- Asegúrese de que a carreira comeza despois de que se completen as comprobacións automáticas previas á execución (~15 minutos). O tempo de execución da secuenciación é de aproximadamente 10h30 min.
- NOTA: Para calquera fallo de comprobación previa, consulte as instrucións do fabricante. Teña coidado de non chocar nin perturbar o NextSeq™ 2000 durante a secuenciación. O instrumento é sensible ás vibracións.
- Limpar a zona de traballo.
Supervisar o progreso da execución
Olink usa NGS como lectura para cuantificar a cantidade dunha secuencia coñecida co fin de estimar a concentración dunha determinada proteína en samples (relativo a outros samples). A calidade dos datos de cada execución de secuenciación Explore está determinada principalmente por parámetros de control de calidade exclusivos da tecnoloxía Olink. Polo tanto, as métricas estándar de control de calidade utilizadas nos NGS convencionais, como o Q-score, son menos críticas.
Expulsa e desbota o cartucho despois da carreira
AVISO: Este conxunto de reactivos contén produtos químicos potencialmente perigosos. Use o equipo de protección adecuado e descarte os reactivos usados de acordo coas normas aplicables. Para obter máis información, consulte a Guía do sistema Illumina NextSeq 1000 e 2000 (documento #1000000109376).
- Cando remate a execución, seleccione Expulsar cartucho.
- NOTA: O cartucho usado, incluída a célula de fluxo, pódese deixar no seu lugar ata a seguinte execución, pero non máis de 3 días.
- Retire o cartucho da bandexa.
- Eliminar os reactivos de acordo coas normas aplicables.
- Seleccione Pechar porta. A bandexa está recargada.
- Seleccione Inicio para volver á pantalla de inicio.
- NOTA: Dado que o cartucho contén todos os mecanismos para executar o sistema, así como un depósito para recoller os reactivos usados, non é necesario lavar o instrumento despois da execución.
Historial de revisións
| Versión | Data | Descrición |
| 1.0 | 2021-12-01 | Novo |
Só para uso de investigación. Non para o seu uso en procedementos de diagnóstico.
Este produto inclúe unha licenza para o uso non comercial dos produtos Olink. Os usuarios comerciais poden requirir licenzas adicionais. Póñase en contacto con Olink Proteomics AB para obter máis detalles. Non hai garantías, expresas ou implícitas, que estean máis aló desta descrición. Olink Proteomics AB non se fai responsable dos danos materiais, danos persoais ou da perda económica causados por este produto. A seguinte marca comercial é propiedade de Olink Proteomics AB: Olink®. Este produto está cuberto por varias patentes e solicitudes de patentes dispoñibles en https://www.olink.com/patents/.
© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Todas as marcas comerciais de terceiros son propiedade dos seus respectivos propietarios.
Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Suecia
1193, v1.0, 2021-12-01
Documentos/Recursos
 |
Olink NextSeq 2000 Explore o sistema de secuenciación [pdfManual do usuario NextSeq 2000, Explore o sistema de secuenciación, NextSeq 2000 Explore o sistema de secuenciación |
