Système de séquençage Olink NextSeq 2000 Explore
Remarque sur les documents
Le manuel utilisateur Olink® Explore, doc nr 1153, est obsolète et a été remplacé par les documents suivants :
- Olink® Explorez plusview Manuel d'utilisation, doc n° 1187
- Olink® Explore 384 Manuel d'utilisation, doc nr 1188
- Olink® Explore 4 x 384 Manuel d'utilisation, doc n° 1189
- Olink® Explore 1536 & Manuel d'utilisation de l'extension, doc nr 1190
- Olink® Explore 3072 Manuel d'utilisation, doc nr 1191
- Olink® Explore Sequencing à l’aide du manuel d’utilisation NextSeq 550, doc nr 1192
- Olink® Explore Sequencing à l’aide du manuel d’utilisation NextSeq 2000, doc nr 1193
- Manuel d'utilisation du séquençage Olink® Explore à l'aide du NovaSeq 6000, doc n° 1194
Introduction
Utilisation prévue
Olink® Explore est une plateforme d'immunodosage multiplex pour la découverte de biomarqueurs de protéines humaines. Le produit est destiné à la recherche uniquement et non à des procédures de diagnostic. Les travaux de laboratoire ne doivent être exécutés que par du personnel de laboratoire formé. Le traitement des données ne doit être effectué que par du personnel formé. Les résultats sont destinés à être utilisés par les chercheurs en conjonction avec d'autres résultats cliniques ou de laboratoire.
À propos de ce manuel
Ce manuel de l'utilisateur fournit les instructions nécessaires pour séquencer les bibliothèques Olink® Explore sur Illumina® NextSeq™ 2000. Les instructions doivent être strictement et explicitement suivies. Tout écart au cours des étapes du laboratoire peut entraîner une détérioration des données. Avant de commencer le flux de travail du laboratoire, consultez le Olink® Explore Overview Manuel de l'utilisateur pour une introduction à la plate-forme, y compris des informations sur les réactifs, l'équipement et la documentation nécessaires, un survolview du flux de travail, ainsi que des directives de laboratoire. Pour obtenir des instructions sur la façon d'exécuter les kits de réactifs Olink® Explore, reportez-vous au manuel de l'utilisateur Olink® Explore applicable. Pour le traitement et l'analyse des données des résultats de la séquence Olink® Explore, reportez-vous au Guide de l'utilisateur Olink® MyData Cloud. Toutes les marques déposées et tous les droits d'auteur contenus dans ce matériel sont la propriété d'Olink® Proteomics AB, sauf indication contraire.
Support technique
Pour une assistance technique, contactez Olink Proteomics à : support@olink.com.
Instructions de laboratoire
Ce chapitre explique comment séquencer les bibliothèques Olink sur NextSeq™ 2000 à l'aide des réactifs NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 cycles) v3. Le protocole utilisé pour le séquençage est une adaptation du flux de travail NGS standard Illumina® pour Illumina® NextSeq™ 2000. Avant de procéder au séquençage, assurez-vous que la qualité de la bibliothèque Olink purifiée a été vérifiée. Reportez-vous au manuel d'utilisation Olink Explore applicable pour obtenir des instructions sur le contrôle qualité.
Planifier le cycle de séquençage
Une bibliothèque Olink peut être séquencée par Flow Cell NextSeq™ 2000 P2 et par analyse. Le nombre de Flow Cells P2 et de cycles requis pour séquencer les différents kits de réactifs Olink Explore est décrit dans le tableau 1. Si plusieurs cycles sont nécessaires, répétez les instructions décrites dans ce manuel.
Tableau 1. Planification du cycle de séquençage
| Kit de réactifs Olink® Explore | Nombre de bibliothèques Olink | Nombre de Flow Cell(s) et run(s) |
| Kit de réactifs Olink® Explore 384 | 1 | 1 |
| Kit de réactifs Olink® Explore 4 x 384 | 4 | 4 |
| Kit de réactifs Olink® Explore 1536 | 4 | 4 |
| Kit de réactifs d'expansion Olink® Explore | 4 | 4 |
| Kit de réactifs Olink® Explore 3072 | 8 | 8 |
Installer la recette personnalisée Olink®
Enregistrez la recette personnalisée Olink xml-file Olink_NSQ2K_P2_V1 dans un dossier d'instrument approprié.
NOTE: La recette personnalisée Olink ne fonctionnera qu'avec le kit NextSeq™ 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 et le logiciel de contrôle NextSeq™ 1000/2000 v1.2 ou v1.4.
Préparer les réactifs de séquençage
Au cours de cette étape, la cartouche de réactifs contenant les réactifs de regroupement et de séquençage est décongelée et la Flow Cell est préparée.
AVERTISSEMENT: La cartouche de réactif contient des produits chimiques potentiellement dangereux. Portez un équipement de protection adéquat et jetez les réactifs utilisés conformément aux normes applicables. Pour plus d'informations, reportez-vous au Guide du système Illumina NextSeq 1000 et 2000 (document n° 1000000109376).
Préparer la cartouche de réactif
La décongélation de la cartouche non ouverte peut être effectuée selon trois méthodes différentes : à température ambiante, dans un bain-marie contrôlé ou au réfrigérateur.
Préparer le banc
- 1 cartouche de réactifs NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 cycles)
Instructions
- Décongeler la cartouche de réactifs comme décrit dans le tableau 2.
Tableau 2. Méthodes de décongélation des cartouches de réactifs
| Méthode de décongélation | Instructions |
| À température ambiante |
|
| Dans un bain-marie |
|
| Dans le réfrigérateur |
|
NOTE: Les cartouches décongelées ne peuvent pas être recongelées et doivent être conservées à 4 °C, pendant une durée maximale de 72 heures.
Préparer la Flow Cell
Préparer le banc
- 1x Cellule à circulation NextSeq™ 1000/2000 P2
Instructions
- Amener la Flow Cell réfrigérée à température ambiante pendant 10 à 15 minutes.
Préparer la bibliothèque Olink® pour le séquençage
Au cours de cette étape, la bibliothèque Olink purifiée et de qualité contrôlée est diluée à la concentration de chargement finale. Notez que la dénaturation de la bibliothèque est effectuée automatiquement à bord de l'instrument.
Préparer le banc
- Lib Tube, préparé conformément au manuel d'utilisation Olink Explore applicable
- 1x RSB avec Tween 20
- Eau MilliQ
- 2x Microtubes à centrifuger (1.5 mL)
- Pipette manuelle (10, 100 et 1000 μL)
- Embouts de pipettes filtrantes
Avant de commencer
- Décongelez le tube Lib s'il est gelé.
- Décongeler le RSB congelé avec du Tween 20 à température ambiante pendant 10 minutes. Conserver à +4 °C jusqu'à utilisation.
- Marquez les deux nouveaux tubes de microcentrifugeuse de 1.5 ml comme suit :
- Marquez un tube "Dil" (pour la bibliothèque diluée au 1:100)
- Marquez un tube "Seq" (pour la bibliothèque prête à charger)
Instructions
- Ajouter 495 μL d'eau MilliQ au tube Dil.
- Vortexez le tube Lib et faites-le tourner brièvement.
- Transférez manuellement 5 μL du tube Lib vers le tube Dil.
- Vortexez le Dil Tube et faites-le tourner brièvement.
- Ajouter 20 μL de RBS avec Tween 20 au Seq Tube.
- Transférez manuellement 20 μL du tube Dil au tube Seq.
- Vortexez le tube Seq et faites-le tourner brièvement.
- Passez immédiatement à 2.5 Charger la Flow Cell et la bibliothèque Olink® dans la cartouche de réactifs.
NOTE: Stocker le(s) tube(s) Lib à -20 °C en cas de réanalyse(s) potentielle(s).
Charger la Flow Cell et la bibliothèque Olink® dans la cartouche de réactifs
Au cours de cette étape, la Flow Cell et la bibliothèque Olink diluée sont chargées dans la cartouche de réactif décongelée.
Préparer le banc
- 1x cartouche de réactif NextSeq™ 1000/2000 P2 décongelée (100 cycles), préparée à l'étape précédente
- 1x Flow Cell NextSeq™ 1000/2000 P2, préparée à l'étape précédente
- Seq Tube (avec bibliothèque Olink diluée prête à charger), préparé à l'étape précédente
- Pipette manuelle (100 μL)
- Pointe de pipette (1 ml)
Préparer la cartouche
- Retirez la cartouche du sachet en feuille d'argent.
- Retourner la cartouche dix fois pour bien mélanger les réactifs décongelés à l'intérieur.
NOTE: Il est normal d'entendre des composants internes tinter.
Charger la Flow Cell dans la cartouche
- Lorsque vous êtes prêt à charger la Flow Cell dans la cartouche, retirez la Flow Cell de l'emballage. Tenez la Flow Cell par la languette grise, avec l'étiquette sur la languette vers le haut. Utilisez de nouveaux gants non poudrés pour éviter de contaminer la surface en verre de la Flow Cell.
- Insérez la Flow Cell dans la fente de Flow Cell à l'avant de la cartouche. Un clic audible indique que la Flow Cell est correctement placée.
- Retirez la languette grise en la tirant.
Charger la bibliothèque Olink® dans la cartouche
- Percez le réservoir de la bibliothèque avec une pointe de pipette propre de 1 mL.
- Chargez 20 μL de la bibliothèque Olink du tube Seq dans le fond du réservoir de la bibliothèque.
Effectuer une analyse de séquençage Olink®
Au cours de cette étape, la cartouche de tampon avec la Flow Cell chargée et la bibliothèque Olink est chargée dans le NextSeq™ 2000, et l'analyse de séquençage est lancée à l'aide de la recette Olink.
Préparer le banc
- 1 cartouche de réactifs NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 cycles) chargée avec la Flow Cell NextSeq™ 1000/2000 P2 et la bibliothèque Olink diluée, préparée à l'étape précédente.
Configurer le mode d'exécution
- Dans le menu du logiciel de contrôle, sélectionnez Paramètres.
- Sous BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support, sélectionnez Local Run Setup.
- Sélectionnez Assistance proactive uniquement comme paramètres supplémentaires. Cette fonction nécessite une connexion Internet.
- Sélectionnez l'emplacement d'hébergement pour vos données. Le lieu d'hébergement doit être situé dans ou à proximité de votre région.
- Définissez l'emplacement du dossier de sortie pour les données brutes de l'exécution en cours. Sélectionnez Choisir pour naviguer et sélectionner le dossier de sortie.
- Cochez la case Dénaturer et diluer à bord pour dénaturer et diluer automatiquement la bibliothèque à bord de l'instrument.
- Cochez la case Purger la cartouche de réactifs pour purger automatiquement les réactifs inutilisés dans le compartiment des réactifs usagés de la cartouche.
- Cochez la case Vérifier automatiquement les mises à jour logicielles pour rechercher automatiquement les mises à jour logicielles (facultatif). Cette fonction nécessite une connexion Internet.
- Sélectionnez Enregistrer.
Configurer les paramètres d'exécution
NOTE: Cette instruction s'applique à la version 1.4 du logiciel de contrôle NextSeq™ 1000/2000. Certaines des étapes décrites ci-dessous peuvent être différentes lors de l'utilisation de la version v1.2
- Dans le menu du logiciel de contrôle, sélectionnez Démarrer.
- Sélectionnez Configurer manuellement une nouvelle analyse et appuyez sur Configuration.
- Dans la page Run Setup, configurez les paramètres d'exécution comme suit :
- Dans le champ Nom de l'exécution, saisissez un ID d'expérience unique.
- Dans la liste déroulante Type de lecture, sélectionnez l'option Lecture unique.
- Entrez le nombre de cycles comme suit :
- Lire 1 : 24
- Indice 1 : 0
- Indice 2 : 0
- Lire 2 : 0
NOTE: Il est crucial que la lecture 1 soit définie sur 24, sinon l'exécution entière échouera. Ignorer les messages d'avertissement lors de la saisie du nombre de cycles.
- Dans la liste déroulante Custom Primer Wells, sélectionnez No.
- Dans le champ Recette personnalisée (facultatif), sélectionnez Choisir pour naviguer et sélectionnez la recette personnalisée XML file Olink_NSQ2K_P2_V1. Sélectionnez Ouvrir.
- Ne pas importer de Sampla Feuille.
- Assurez-vous que l'emplacement du dossier de sortie est correct. Sinon, sélectionnez Choisir pour naviguer et sélectionner l'emplacement du dossier de sortie souhaité.
- Dans le champ Dénaturer et diluer à bord, sélectionnez Activé dans la liste déroulante.
- Sélectionnez Prép.
Charger la cartouche chargée
- Sélectionnez Charger. La visière de l'instrument s'ouvre et le plateau est éjecté.
- Placez la cartouche chargée sur le plateau avec l'étiquette vers le haut et la Flow Cell à l'intérieur de l'instrument.
- Sélectionnez Fermer.
- Une fois la cartouche correctement chargée, vérifiez les paramètres d'analyse et sélectionnez Séquence. L'instrument effectue des vérifications préalables pour l'instrument et la fluidique.
- NOTE: Lors de la vérification fluidique, on s'attend à entendre plusieurs claquements.
- Assurez-vous que l'analyse démarre une fois les vérifications automatiques préalables à l'analyse terminées (~15 minutes). La durée d'exécution du séquençage est d'environ 10h30 min.
- NOTE: Pour tout échec de la vérification préalable, reportez-vous aux instructions du fabricant. Veillez à ne pas heurter ou déranger le NextSeq™ 2000 pendant l'analyse de séquençage. L'instrument est sensible aux vibrations.
- Nettoyez la zone de travail.
Surveiller la progression de l'exécution
Olink utilise NGS comme lecture pour quantifier la quantité d'une séquence connue afin d'estimer la concentration d'une protéine donnée en samples (par rapport aux autres samples). La qualité des données de chaque cycle de séquençage Explore est principalement déterminée par les paramètres de CQ propres à la technologie Olink. Par conséquent, les mesures de contrôle qualité standard utilisées dans les NGS conventionnels, telles que le score Q, sont moins critiques.
Éjectez et jetez la cartouche après l'analyse
AVERTISSEMENT: Cet ensemble de réactifs contient des produits chimiques potentiellement dangereux. Portez un équipement de protection adéquat et jetez les réactifs utilisés conformément aux normes applicables. Pour plus d'informations, reportez-vous au Guide du système Illumina NextSeq 1000 et 2000 (document n° 1000000109376).
- Une fois l'analyse terminée, sélectionnez Éjecter la cartouche.
- NOTE: La cartouche usagée, y compris la Flow Cell, peut être laissée en place jusqu'à la prochaine analyse, mais pas plus de 3 jours.
- Retirez la cartouche du bac.
- Éliminer les réactifs conformément aux normes applicables.
- Sélectionnez Fermer la porte. Le plateau est rechargé.
- Sélectionnez Accueil pour revenir à l'écran d'accueil.
- NOTE: Étant donné que la cartouche contient tous les mécanismes pour faire fonctionner le système, ainsi qu'un réservoir pour collecter les réactifs utilisés, il n'est pas nécessaire de laver l'instrument après l'analyse.
Historique des révisions
| Version | Date | Description |
| 1.0 | 2021-12-01 | Nouveau |
À des fins de recherche uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
Ce produit inclut une licence pour l'utilisation non commerciale des produits Olink. Les utilisateurs commerciaux peuvent avoir besoin de licences supplémentaires. Veuillez contacter Olink Proteomics AB pour plus de détails. Il n'y a aucune garantie, expresse ou implicite, qui s'étend au-delà de cette description. Olink Proteomics AB n'est pas responsable des dommages matériels, des blessures corporelles ou des pertes économiques causés par ce produit. La marque commerciale suivante appartient à Olink Proteomics AB : Olink®. Ce produit est couvert par plusieurs brevets et demandes de brevets disponibles sur https://www.olink.com/patents/.
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1193, v1.0, 2021-12-01
Documents / Ressources
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Système de séquençage Olink NextSeq 2000 Explore [pdf] Manuel de l'utilisateur NextSeq 2000, Explorez le système de séquençage, NextSeq 2000 Explorez le système de séquençage |
