Uživatelská příručka Olink NextSeq 2000 Explore Sequencing System

Olink® Explore je platforma multiplexního imunotestu pro objevování biomarkerů lidských proteinů. Produkt je určen pouze pro výzkumné použití, nikoli pro použití v diagnostických postupech. Laboratorní práce smí provádět pouze vyškolený laboratorní personál. Zpracování dat smí provádět pouze vyškolený personál. Výsledky jsou určeny pro použití výzkumníky ve spojení s jinými klinickými nebo laboratorními nálezy.

O tomto návodu

Tato uživatelská příručka poskytuje pokyny potřebné k sekvenčnímu řazení knihoven Olink® Explore na Illumina® NextSeq™ 2000. Pokyny musí být přísně a výslovně dodržovány. Jakékoli odchylky v průběhu laboratorních kroků mohou vést ke zhoršení dat. Před zahájením laboratorního pracovního postupu si prostudujte Olink® Explore Overview Uživatelská příručka pro úvod do platformy, včetně informací o reagenciích, potřebném vybavení a dokumentaci, konecview pracovního postupu a také laboratorních pokynů. Pokyny, jak používat reagenční sady Olink® Explore, naleznete v příslušné uživatelské příručce Olink® Explore. Pro zpracování dat a analýzu výsledků sekvence Olink® Explore viz Uživatelská příručka Olink® MyData Cloud. Všechny ochranné známky a autorská práva obsažená v tomto materiálu jsou majetkem společnosti Olink® Proteomics AB, pokud není uvedeno jinak.

Technická podpora

Pro technickou podporu kontaktujte Olink Proteomics na adrese: podpora@olink.com.

Laboratorní instrukce

Tato kapitola poskytuje pokyny, jak sekvenovat knihovny Olink na NextSeq™ 2000 pomocí NextSeq™ 1000/2000 P2 reagencií (100 cyklů) v3. Protokol použitý pro sekvenování je adaptací standardního pracovního postupu NGS Illumina® pro Illumina® NextSeq™ 2000. Než přistoupíte k sekvenování, ujistěte se, že byla ověřena kvalita vyčištěné knihovny Olink. Pokyny týkající se kontroly kvality naleznete v příslušné uživatelské příručce Olink Explore.

Naplánujte běh sekvenování

Jedna knihovna Olink může být sekvenována na průtokovou kyvetu NextSeq™ 2000 P2 a na běh. Počet průtokových kyvet P2 a cyklů potřebných k sekvenování různých reagenčních souprav Olink Explore je popsán v tabulce 1. Pokud je zapotřebí více než jeden běh, zopakujte pokyny popsané v této příručce.

Tabulka 1. Plánování běhu sekvenování

Reagenční sada Olink® Explore	Počet knihoven Olink	Počet průtokových buněk a běhů
Reagenční sada Olink® Explore 384	1	1
Reagenční sada Olink® Explore 4 x 384	4	4
Reagenční sada Olink® Explore 1536	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Reagenční sada Olink® Explore 3072	8	8

Nainstalujte si vlastní recepturu Olink®

Uložit vlastní recept Olink xml-file Olink_NSQ2K_P2_V1 v příslušné složce přístroje.

POZNÁMKA: Vlastní receptura Olink bude fungovat pouze se sadou NextSeq™ 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 kit a řídicím softwarem NextSeq™ 1000/2000 v1.2 nebo v1.4.

Připravte sekvenační činidla

Během tohoto kroku se reagenční kazeta obsahující shlukovací a sekvenační činidla rozmrazí a připraví se průtoková cela.

VAROVÁNÍ: Zásobník s reagenciemi obsahuje potenciálně nebezpečné chemikálie. Používejte vhodné ochranné prostředky a použité reagencie zlikvidujte v souladu s platnými normami. Další informace naleznete v Průvodci systémem Illumina NextSeq 1000 a 2000 (dokument č. 1000000109376).

Připravte kazetu s reagenciemi

Rozmrazování neotevřené kartuše lze provést třemi různými způsoby: při pokojové teplotě, v kontrolované vodní lázni nebo v chladničce.

Připravte lavici

1x Zásobník s reagenciemi NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 cyklů)

Instrukce

Rozmrazte kazetu s reagenciemi, jak je popsáno v tabulce 2.

Tabulka 2. Metody rozmrazování kazety s reagenciemi

Metoda rozmrazování	Instrukce
Při pokojové teplotě	Bez otevření sáčku se stříbrnou fólií umístěte kazetu se zmrazeným činidlem na pracovní stůl a rozmrazte ji při pokojové teplotě po dobu 9 hodin. Nepřekračujte 16 hodin. Ujistěte se, že štítek sáčku směřuje nahoru a že kolem kazety může cirkulovat vzduch.
Ve vodní lázni	Bez otevření sáčku se stříbrnou fólií umístěte kazetu se zmrazeným činidlem napůl ponořenou do vodní lázně s kontrolovanou teplotou 25 °C a nechte ji 6 hodin rozmrazit. Nepřekračujte 8 hodin. Ujistěte se, že štítek sáčku směřuje nahoru a že se kazeta během rozmrazování nepřevrací. Kazetu důkladně osušte papírovou utěrkou.
V lednici	Bez otevření sáčku se stříbrnou fólií položte kazetu na pracovní stůl a rozmrazujte ji při pokojové teplotě po dobu 6 hodin. Ujistěte se, že štítek sáčku směřuje nahoru a že kolem kazety může cirkulovat vzduch. Dokončete rozmrazování kazety v chladničce po dobu 12 hodin. Nepřekračujte 72 hodin. Před měřením vyjměte rozmraženou neotevřenou kazetu z chladničky a nechte ji dosáhnout pokojové teploty po dobu alespoň 15 minut, ale ne déle než 1 hodinu.

POZNÁMKA: Rozmražené kazety nelze znovu zmrazit a musí být skladovány při teplotě 4 °C po dobu maximálně 72 hodin.

Připravte průtokovou celu

Připravte lavici

1x průtoková buňka NextSeq™ 1000/2000 P2

Instrukce

Přiveďte chlazenou průtokovou celu na pokojovou teplotu na 10-15 minut.

Připravte Olink® Library pro sekvenování

Během tohoto kroku se vyčištěná a kvalitativně kontrolovaná knihovna Olink zředí na konečnou nanášecí koncentraci. Všimněte si, že denaturace knihovny se provádí automaticky na palubě přístroje.

Připravte lavici

Lib Tube, připravená podle příslušné uživatelské příručky Olink Explore
1x RSB s Tween 20
MilliQ voda
2x mikrocentrifugační zkumavky (1.5 ml)
Ruční pipeta (10, 100 a 1000 μL)
Filtrujte špičky pipet

Než začnete

Rozmrazte Lib Tube, pokud je zmrazená.
Rozmrazte zmrazené RSB pomocí Tween 20 při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Do použití skladujte při +4 °C.
Označte dvě nové 1.5ml mikrocentrifugační zkumavky následovně:
- Označte jednu zkumavku „Dil“ (pro knihovnu zředěnou 1:100)
- Označte jednu zkumavku „Seq“ (pro knihovnu připravenou k načtení)

Instrukce

Přidejte 495 μl vody MilliQ do zkumavky Dil.

Vortexujte Lib Tube a krátce ji roztočte.
Ručně přeneste 5 μl z Lib Tube do Dil Tube.
Vortexujte Dil Tube a krátce ji otočte dolů.

Přidejte 20 μl RBS s Tween 20 do zkumavky Seq.
Ručně přeneste 20 μl z Dil Tube do Seq Tube.
Vortexujte Seq Tube a krátce ji roztočte.

Okamžitě pokračujte krokem 2.5 Vložte průtokovou kyvetu a knihovnu Olink® do kazety s reagenciemi.

POZNÁMKA: Uchovávejte Lib Tube(y) při -20 °C pro případ možného opětovného spuštění.

Vložte průtokovou kyvetu a knihovnu Olink® do kazety s reagenciemi

Během tohoto kroku jsou průtoková kyveta a zředěná knihovna Olink vloženy do rozmražené kazety s reagenciemi.

Připravte lavici

1x rozmražená kazeta s reagenciemi NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 cyklů), připravená v předchozím kroku
1x NextSeq™ 1000/2000 P2 Flow Cell, připravený v předchozím kroku

Seq Tube (s připravenou k načtení zředěné knihovny Olink), připravené v předchozím kroku
Ruční pipeta (100 μL)
Pipetovací špička (1 ml)

Připravte kazetu

Vyjměte kazetu ze stříbrného sáčku.
Desetkrát otočte kazetu, aby se rozmražená činidla důkladně promíchala.

POZNÁMKA: Je normální slyšet cinkání vnitřních součástí.

Vložte průtokovou kyvetu do kazety

Až budete připraveni vložit průtokovou kyvetu do kazety, vyjměte průtokovou kyvetu z obalu. Uchopte průtokovou kyvetu za šedý štítek tak, aby štítek na štítku směřoval nahoru. Používejte nové rukavice bez pudru, abyste zabránili kontaminaci skleněného povrchu průtokové cely.
Vložte průtokovou kyvetu do štěrbiny průtokové kyvety na přední straně kazety. Slyšitelné cvaknutí signalizuje, že průtoková cela je správně umístěna.

Odstraňte šedý jazýček vytažením.

Vložte Olink® Library do kazety

Propíchněte zásobník knihovny čistou špičkou 1 ml pipety.

Naplňte 20 μl knihovny Olink ze zkumavky Seq na dno zásobníku knihovny.

Proveďte sekvenační běh Olink®

Během tohoto kroku se do NextSeq™ 2000 vloží zásobník pufru s naloženou průtokovou kyvetou a knihovnou Olink a spustí se sekvenování pomocí receptury Olink.

Připravte lavici

1x Zásobník s reagenciemi NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 cyklů) naplněný průtokovou kyvetou NextSeq™ 1000/2000 P2 a naředěnou knihovnou Olink, připravenou v předchozím kroku.

Nakonfigurujte režim běhu

Z nabídky ovládacího softwaru vyberte Nastavení.

V části BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support vyberte Local Run Setup.
Jako další nastavení vyberte možnost Pouze proaktivní podpora. Tato funkce vyžaduje připojení k internetu.
Vyberte umístění hostitele pro svá data. Umístění hostitele by mělo být ve vašem regionu nebo v jeho blízkosti.

Nastavte umístění výstupní složky pro aktuální nezpracovaná data. Vyberte Vybrat pro navigaci a výběr výstupní složky.
Zaškrtněte políčko Denature and Dilute On Board pro automatickou denaturaci a ředění knihovny na palubě přístroje.
Zaškrtněte políčko Purge Reagent Cartridge, chcete-li automaticky vyprázdnit nepoužité reagencie do přihrádky na použité reagencie v kazetě.

Zaškrtněte políčko Automaticky kontrolovat aktualizace softwaru pro automatickou kontrolu aktualizací softwaru (volitelné). Tato funkce vyžaduje připojení k internetu.
Vyberte Uložit.

Nastavte parametry běhu

POZNÁMKA: Tento pokyn platí pro verzi 1.4 ovládacího softwaru NextSeq™ 1000/2000. Některé z níže popsaných kroků se mohou při použití verze v1.2 lišit

V nabídce ovládacího softwaru vyberte Start.
Vyberte Manually Set Up New Run a stiskněte Setup.
Na stránce Run Setup nastavte parametry běhu následovně:
- Do pole Run Name zadejte jedinečné ID experimentu.
- V rozevíracím seznamu Typ čtení vyberte možnost Jedno čtení.
- Zadejte počet cyklů následovně:
  - Přečtěte si 1: 24
  - Index 1: 0
  - Index 2: 0
  - Přečtěte si 2: 0

POZNÁMKA: Je důležité, aby Read 1 bylo nastaveno na 24, jinak celý běh selže. Při zadávání počtu cyklů ignorujte varovné zprávy.

V rozevíracím seznamu Custom Primer Wells vyberte No.

V poli Vlastní recept (volitelné) vyberte možnost Vybrat pro navigaci a vyberte XML uživatelského receptu file Olink_NSQ2K_P2_V1. Vyberte Otevřít.
Neimportujte Sample List.
Ujistěte se, že umístění výstupní složky je správné. V opačném případě vyberte možnost Vybrat pro navigaci a vyberte požadované umístění výstupní složky.

V poli Denature and Dilute Onboard vyberte z rozevíracího seznamu možnost Enabled.
Vyberte Prep.

Vložte vloženou kazetu

Vyberte Načíst. Kryt přístroje se otevře a zásobník se vysune.
Umístěte naplněnou kazetu na tác štítkem nahoru a průtokovou kyvetou uvnitř přístroje.
Vyberte Zavřít.

Jakmile je kazeta správně vložena, ověřte parametry běhu a vyberte Sequence. Přístroj provádí předběžné kontroly přístroje a tekutin.
- POZNÁMKA: Během kontroly tekutin se očekává, že uslyšíte několik praskavých zvuků.
Ujistěte se, že běh začíná po dokončení automatických kontrol před spuštěním (~15 minut). Doba běhu sekvenování je přibližně 10 hodin 30 minut.
- POZNÁMKA: V případě jakýchkoli selhání kontroly před spuštěním se řiďte pokyny výrobce. Dávejte pozor, abyste nenarazili nebo jinak nenarušili NextSeq™ 2000 během sekvenování. Přístroj je citlivý na vibrace.
Vyčistěte pracovní plochu.

Sledujte průběh běhu

Olink používá NGS jako výstup ke kvantifikaci množství známé sekvence, aby mohl odhadnout koncentraci daného proteinu v samples (ve vztahu k jiným samples). Kvalita dat z každého běhu sekvenování Explore je určena především parametry QC jedinečnými pro technologii Olink. Standardní metriky kontroly kvality používané v konvenčních NGS, jako je Q-score, jsou tedy méně kritické.

Po běhu kazetu vyjměte a zlikvidujte

VAROVÁNÍ: Tato sada činidel obsahuje potenciálně nebezpečné chemikálie. Používejte vhodné ochranné prostředky a použité reagencie zlikvidujte v souladu s platnými normami. Další informace naleznete v Průvodci systémem Illumina NextSeq 1000 a 2000 (dokument č. 1000000109376).

Po dokončení cyklu vyberte možnost Vysunout kazetu.
- POZNÁMKA: Použitou kazetu včetně průtokové kyvety lze ponechat na místě do dalšího běhu, ne však déle než 3 dny.
Vyjměte kazetu ze zásobníku.
Reagencie zlikvidujte v souladu s platnými normami.

Vyberte možnost Zavřít dveře. Zásobník je znovu vložen.
Chcete-li se vrátit na domovskou obrazovku, vyberte možnost Domů.
- POZNÁMKA: Vzhledem k tomu, že kazeta obsahuje všechny mechanismy pro provoz systému, stejně jako zásobník pro shromažďování použitých reagencií, není nutné po běhu oplachovat nástroje.

Historie revizí

Verze	Datum	Popis
1.0	2021-12-01	Nový

www.olink.com

Pouze pro výzkumné použití. Není určeno pro diagnostické postupy.

Tento produkt zahrnuje licenci pro nekomerční použití produktů Olink. Komerční uživatelé mohou vyžadovat další licence. Podrobnosti vám sdělí společnost Olink Proteomics AB. Neexistují žádné záruky, vyjádřené nebo předpokládané, které přesahují tento popis. Společnost Olink Proteomics AB nenese odpovědnost za škody na majetku, zranění osob nebo ekonomické ztráty způsobené tímto produktem. Následující ochranná známka je majetkem společnosti Olink Proteomics AB: Olink®. Tento produkt je chráněn několika patenty a patentovými přihláškami dostupnými na https://www.olink.com/patents/.

Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Švédsko

1193, v1.0, 2021-12-01

Dokumenty / zdroje

Olink NextSeq 2000 Explore Sequencing System [pdfUživatelská příručka
NextSeq 2000, Explore Sequencing System, NextSeq 2000 Explore Sequencing System

Reference

Uživatelská příručka

Olink NextSeq 2000 Explore Sequencing System

Poznámka k dokumentu

Zavedení

Technická podpora

Laboratorní instrukce

Připravte sekvenační činidla

Připravte kazetu s reagenciemi

Připravte průtokovou celu

Připravte Olink® Library pro sekvenování

Vložte průtokovou kyvetu a knihovnu Olink® do kazety s reagenciemi

Vložte průtokovou kyvetu do kazety

Proveďte sekvenační běh Olink®

Nastavte parametry běhu

Po běhu kazetu vyjměte a zlikvidujte

Historie revizí

Dokumenty / zdroje

Reference

Zanechte komentář

Zrušit odpověď