Olink NextSeq 2000 Explore Sequenziersystem

Olink® Explore ist eine Multiplex-Immunoassay-Plattform für die Entdeckung menschlicher Protein-Biomarker. Das Produkt ist nur für Forschungszwecke bestimmt und nicht für diagnostische Verfahren. Die Laborarbeiten dürfen nur von geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Die Datenverarbeitung erfolgt nur durch geschultes Personal. Die Ergebnisse sollen von Forschern in Verbindung mit anderen klinischen oder Laborbefunden verwendet werden.

Über dieses Handbuch

Dieses Benutzerhandbuch enthält die Anweisungen, die zum Sequenzieren von Olink® Explore Libraries auf Illumina® NextSeq™ 2000 erforderlich sind. Die Anweisungen müssen strikt und ausdrücklich befolgt werden. Jegliche Abweichungen während der Laborschritte können zu beeinträchtigten Daten führen. Bevor Sie mit dem Labor-Workflow beginnen, konsultieren Sie das Olink® Explore Overview Benutzerhandbuch für eine Einführung in die Plattform, einschließlich Informationen über Reagenzien, benötigte Ausrüstung und Dokumentation, sowie ein Overview des Arbeitsablaufs sowie Laborrichtlinien. Anweisungen zum Ausführen der Olink® Explore-Reagenzienkits finden Sie im entsprechenden Olink® Explore-Benutzerhandbuch. Informationen zur Datenverarbeitung und Analyse der Ergebnisse der Olink® Explore-Sequenz finden Sie im Olink® MyData Cloud-Benutzerhandbuch. Alle in diesem Material enthaltenen Warenzeichen und Urheberrechte sind Eigentum von Olink® Proteomics AB, sofern nicht anders angegeben.

Technische Unterstützung

Wenden Sie sich für technischen Support an Olink Proteomics unter: support@olink.com.

Laboranweisungen

Dieses Kapitel enthält Anweisungen zur Sequenzierung von Olink-Bibliotheken auf NextSeq™ 2000 unter Verwendung der NextSeq™ 1000/2000 P2-Reagenzien (100 Zyklen) v3. Das für die Sequenzierung verwendete Protokoll ist eine Anpassung des Illumina®-Standard-NGS-Arbeitsablaufs für Illumina® NextSeq™ 2000. Bevor Sie mit der Sequenzierung fortfahren, stellen Sie sicher, dass die Qualität der gereinigten Olink-Bibliothek überprüft wurde. Anweisungen zur Qualitätskontrolle finden Sie im entsprechenden Olink Explore-Benutzerhandbuch.

Planen Sie den Sequenzierungslauf

Pro NextSeq™ 2000 P2-Fließzelle und Lauf kann eine Olink-Bibliothek sequenziert werden. Die Anzahl der P2-Durchflusszellen und Läufe, die für die Sequenzierung der verschiedenen Olink Explore-Reagenzienkits erforderlich sind, ist in Tabelle 1 beschrieben. Wenn mehr als ein Lauf erforderlich ist, wiederholen Sie die in diesem Handbuch beschriebenen Anweisungen.

Tabelle 1. Sequenzierungslaufplanung

Olink® Explore-Reagenzkit	Anzahl der Olink-Bibliotheken	Anzahl Fließzelle(n) und Lauf(e)
Olink® Explore 384 Reagenzkit	1	1
Olink® Explore 4 x 384 Reagenzkit	4	4
Olink® Explore 1536 Reagenzkit	4	4
Olink® Explore Erweiterungsreagenzien-Kit	4	4
Olink® Explore 3072 Reagenzkit	8	8

Installieren Sie das benutzerdefinierte Rezept von Olink®

Speichern Sie das benutzerdefinierte Olink-Rezept xml-file Olink_NSQ2K_P2_V1 in einem geeigneten Instrumentenordner.

NOTIZ: Das benutzerdefinierte Olink-Rezept funktioniert nur mit dem NextSeq™ 1000/2000 P2-Reagenzien (100 Zyklen) v3-Kit und der NextSeq™ 1000/2000-Steuerungssoftware v1.2 oder v1.4.

Bereiten Sie Sequenzierungsreagenzien vor

Während dieses Schritts wird die Reagenzienkartusche mit Clustering- und Sequenzierungsreagenzien aufgetaut und die Fließzelle vorbereitet.

WARNUNG: Die Reagenzienkartusche enthält potenziell gefährliche Chemikalien. Tragen Sie angemessene Schutzausrüstung und entsorgen Sie gebrauchte Reagenzien gemäß den geltenden Standards. Weitere Informationen finden Sie im Illumina NextSeq 1000 and 2000 System Guide (Dokument-Nr. 1000000109376).

Bereiten Sie die Reagenzienkartusche vor

Das Auftauen der ungeöffneten Kartusche kann auf drei verschiedene Arten erfolgen: bei Raumtemperatur, in einem kontrollierten Wasserbad oder im Kühlschrank.

Bank vorbereiten

1x NextSeq™ 1000/2000 P2-Reagenzienkartusche (100 Zyklen)

Anweisungen

Tauen Sie die Reagenzienkartusche wie in Tabelle 2 beschrieben auf.

Tabelle 2. Auftaumethoden für Reagenzienkartuschen

Auftaumethode	Anweisungen
Bei Zimmertemperatur	Legen Sie die gefrorene Reagenzienkartusche auf den Tisch, ohne den Silberfolienbeutel zu öffnen, und tauen Sie sie 9 Stunden lang bei Raumtemperatur auf. 16 Stunden nicht überschreiten. Achten Sie darauf, dass das Beuteletikett nach oben zeigt und Luft um die Kartusche zirkulieren kann.
Im Wasserbad	Legen Sie die gefrorene Reagenzienkartusche, ohne den Silberfolienbeutel zu öffnen, halb eingetaucht in ein Wasserbad mit kontrollierter Temperatur von 25 °C und lassen Sie sie 6 Stunden lang auftauen. 8 Stunden nicht überschreiten. Stellen Sie sicher, dass das Beuteletikett nach oben zeigt und dass die Patrone beim Auftauen nicht umgedreht wird. Trocknen Sie die Patrone gründlich mit einem Papiertuch.
Im Kühlschrank	Legen Sie die Kartusche auf den Labortisch, ohne den Silberfolienbeutel zu öffnen, und tauen Sie sie 6 Stunden lang bei Raumtemperatur auf. Achten Sie darauf, dass das Beuteletikett nach oben zeigt und Luft um die Kartusche zirkulieren kann. Beenden Sie das Auftauen der Patrone im Kühlschrank für 12 Stunden. 72 Stunden nicht überschreiten. Nehmen Sie vor dem Lauf die aufgetaute ungeöffnete Kartusche aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie mindestens 15 Minuten, aber nicht länger als 1 Stunde lang Raumtemperatur erreichen.

NOTIZ: Aufgetaute Patronen können nicht wieder eingefroren werden und müssen bei 4 °C für maximal 72 Stunden gelagert werden.

Bereiten Sie die Durchflusszelle vor

Bank vorbereiten

1 x NextSeq™ 1000/2000 P2-Fließzelle

Anweisungen

Bringen Sie die gekühlte Durchflusszelle für 10-15 Minuten auf Raumtemperatur.

Bereiten Sie die Olink® Library für die Sequenzierung vor

Während dieses Schritts wird die gereinigte und qualitätskontrollierte Olink-Bibliothek auf die endgültige Ladekonzentration verdünnt. Beachten Sie, dass die Denaturierung der Bibliothek automatisch im Gerät durchgeführt wird.

Bank vorbereiten

Lib Tube, hergestellt gemäß dem geltenden Olink Explore Benutzerhandbuch

1x RSB mit Tween 20
MilliQ-Wasser
2x Mikrozentrifugenröhrchen (1.5 ml)
Manuelle Pipette (10, 100 und 1000 μL)
Filterpipettenspitzen

Bevor Sie beginnen

Tauen Sie das Lib-Röhrchen auf, wenn es gefroren ist.
Tauen Sie das gefrorene RSB mit Tween 20 bei Raumtemperatur für 10 Minuten auf. Bis zur Verwendung bei +4 °C lagern.
Markieren Sie die beiden neuen 1.5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen wie folgt:
- Markieren Sie ein Röhrchen mit „Dil“ (für die 1:100 verdünnte Bibliothek)
- Markieren Sie ein Röhrchen „Seq“ (für die ladebereite Bibliothek)

Anweisungen

Geben Sie 495 μl MilliQ-Wasser in das Dil-Röhrchen.

Vortexen Sie das Lib Tube und drehen Sie es kurz herunter.
Übertragen Sie manuell 5 μl aus dem Lib-Röhrchen in das Dil-Röhrchen.
Vortexen Sie das Dil-Röhrchen und drehen Sie es kurz herunter.
Fügen Sie dem Seq-Röhrchen 20 μl RBS mit Tween 20 hinzu.

Übertragen Sie manuell 20 μl aus dem Dil-Röhrchen in das Seq-Röhrchen.
Vortexen Sie das Seq Tube und drehen Sie es kurz herunter.
Fahren Sie sofort mit 2.5 Laden der Fließzelle und der Olink®-Bibliothek in die Reagenzienkartusche fort.

NOTIZ: Lagern Sie das/die Lib-Röhrchen bei -20 °C im Falle einer möglichen Wiederholung(en).

Laden Sie die Fließzelle und die Olink®-Bibliothek in die Reagenzienkartusche

Während dieses Schritts werden die Fließzelle und die verdünnte Olink Library in die aufgetaute Reagenzienkartusche geladen.

Bank vorbereiten

1x aufgetaute NextSeq™ 1000/2000 P2-Reagenzienkartusche (100 Zyklen), vorbereitet im vorherigen Schritt
1x NextSeq™ 1000/2000 P2-Fließzelle, vorbereitet im vorherigen Schritt

Seq Tube (mit ladefertig verdünnter Olink Library), vorbereitet im vorherigen Schritt
Manuelle Pipette (100 μl)
Pipettenspitze (1 ml)

Bereiten Sie die Patrone vor

Entfernen Sie die Patrone aus dem Silberfolienbeutel.
Drehen Sie die Kartusche zehnmal um, um die aufgetauten Reagenzien darin gründlich zu mischen.

NOTIZ: Es ist normal, interne Komponenten klingeln zu hören.

Laden Sie die Fließzelle in die Kartusche

Wenn Sie bereit sind, die Fließzelle in die Kartusche zu laden, nehmen Sie die Fließzelle aus der Verpackung. Halten Sie die Fließzelle an der grauen Lasche, sodass das Etikett auf der Lasche nach oben zeigt. Verwenden Sie neue, puderfreie Handschuhe, um eine Kontamination der Glasoberfläche der Durchflusszelle zu vermeiden.
Setzen Sie die Fließzelle in den Fließzellensteckplatz an der Vorderseite der Kartusche ein. Ein hörbares Klicken zeigt an, dass die Durchflusszelle richtig platziert ist.
Entfernen Sie die graue Lasche, indem Sie sie herausziehen.

Laden Sie die Olink®-Bibliothek in die Kassette

Durchstechen Sie das Library-Reservoir mit einer sauberen 1-ml-Pipettenspitze.
Laden Sie 20 μl der Olink-Bibliothek aus dem Seq-Röhrchen in den Boden des Bibliotheksbehälters.

Führen Sie einen Olink®-Sequenzierungslauf durch

Während dieses Schritts wird die Pufferkartusche mit der geladenen Fließzelle und der Olink-Bibliothek in das NextSeq™ 2000 geladen und der Sequenzierungslauf mit dem Olink-Rezept gestartet.

Bank vorbereiten

1x NextSeq™ 1000/2000 P2-Reagenzienkartusche (100 Zyklen), geladen mit der NextSeq™ 1000/2000 P2-Fließzelle und der verdünnten Olink-Bibliothek, die im vorherigen Schritt vorbereitet wurde.

Konfigurieren Sie den Ausführungsmodus

Wählen Sie im Menü der Steuerungssoftware die Option Einstellungen.
Wählen Sie unter BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support die Option Local Run Setup aus.
Wählen Sie als zusätzliche Einstellungen Nur proaktiver Support aus. Diese Funktion erfordert eine Internetverbindung.
Wählen Sie den Hosting-Standort für Ihre Daten aus. Der Hosting-Standort sollte sich in oder in der Nähe Ihrer Region befinden.
Legen Sie den Speicherort des Ausgabeordners für die Rohdaten des aktuellen Laufs fest. Wählen Sie Auswählen, um zu navigieren und den Ausgabeordner auszuwählen.
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen „Denature and Dilute On Board“, um die Bibliothek automatisch im Gerät zu denaturieren und zu verdünnen.
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Purge Reagent Cartridge (Purge Reagent Cartridge), um nicht verwendete Reagenzien automatisch in das Fach für verbrauchte Reagenzien der Kartusche zu spülen.
Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Automatisch nach Software-Updates suchen, um automatisch nach Software-Updates zu suchen (optional). Diese Funktion erfordert eine Internetverbindung.
Wählen Sie Speichern aus.

Richten Sie Laufparameter ein

NOTIZ: Diese Anleitung gilt für Version 1.4 der NextSeq™ 1000/2000-Steuerungssoftware. Einige der unten beschriebenen Schritte können bei Verwendung der Version v1.2 anders sein

Wählen Sie im Menü der Steuerungssoftware Start.
Wählen Sie Neuen Lauf manuell einrichten und drücken Sie Setup.
Richten Sie auf der Seite Run Setup die Laufparameter wie folgt ein:
- Geben Sie im Feld Laufname eine eindeutige Experiment-ID ein.
- Wählen Sie in der Dropdown-Liste Read Type die Option Single Read aus.
- Geben Sie die Anzahl der Zyklen wie folgt ein:
  - Lesen Sie 1: 24
  - Index 1: 0
  - Index 2: 0
  - Lesen Sie 2: 0

NOTIZ: Entscheidend ist, dass Read 1 auf 24 steht, sonst schlägt der gesamte Lauf fehl. Ignorieren Sie die Warnmeldungen bei der Eingabe der Zyklenzahl.

Wählen Sie in der Dropdown-Liste Custom Primer Wells die Option No aus.
Wählen Sie im Feld „Benutzerdefiniertes Rezept (optional)“ die Option „Zum Navigieren auswählen“ und wählen Sie das benutzerdefinierte Rezept-XML aus file Olink_NSQ2K_P2_V1. Wählen Sie Öffnen aus.
Importieren Sie kein Sample Blatt.
Stellen Sie sicher, dass der Speicherort des Ausgabeordners korrekt ist. Wählen Sie andernfalls Auswählen, um zu navigieren, und wählen Sie den gewünschten Speicherort für den Ausgabeordner aus.

Wählen Sie im Feld Denature and Dilute Onboard die Option Enabled aus der Dropdown-Liste aus.
Wählen Sie Vorbereitung.

Legen Sie die geladene Kassette ein

Wählen Sie Laden. Das Instrumentenvisier öffnet sich und das Tablett wird ausgeworfen.
Legen Sie die geladene Kartusche mit dem Etikett nach oben und der Fließzelle in das Gerät auf das Tablett.

Wählen Sie Schließen aus.
Sobald die Kartusche richtig geladen ist, überprüfen Sie die Laufparameter und wählen Sie Sequenz. Das Instrument führt Vorlaufprüfungen für das Instrument und die Fluidik durch.
- NOTIZ: Während der Fluidikprüfung ist mit mehreren Knallgeräuschen zu rechnen.
Stellen Sie sicher, dass der Lauf beginnt, nachdem die automatischen Tests vor dem Lauf abgeschlossen sind (ca. 15 Minuten). Die Sequenzierungslaufzeit beträgt ca. 10h30 min.
- NOTIZ: Bei fehlgeschlagenen Vorlaufprüfungen die Anweisungen des Herstellers beachten. Achten Sie darauf, während des Sequenzierungslaufs nicht gegen das NextSeq™ 2000 zu stoßen oder es anderweitig zu stören. Das Instrument ist empfindlich gegenüber Vibrationen.
Reinigen Sie den Arbeitsbereich.

Lauffortschritt überwachen

Olink verwendet NGS als Anzeige, um die Menge einer bekannten Sequenz zu quantifizieren, um die Konzentration eines bestimmten Proteins in s abzuschätzenamples (relativ zu anderen samples). Die Datenqualität jedes Explore-Sequenzierungslaufs wird hauptsächlich durch QC-Parameter bestimmt, die für die Olink-Technologie einzigartig sind. Daher sind Standard-Qualitätskontrollmetriken, die in herkömmlichen NGS verwendet werden, wie z. B. Q-Score, weniger kritisch.

Werfen Sie die Kassette nach dem Lauf aus und entsorgen Sie sie

WARNUNG: Dieses Reagenzienset enthält potenziell gefährliche Chemikalien. Tragen Sie angemessene Schutzausrüstung und entsorgen Sie gebrauchte Reagenzien gemäß den geltenden Standards. Weitere Informationen finden Sie im Illumina NextSeq 1000 and 2000 System Guide (Dokument-Nr. 1000000109376).

Wenn der Lauf abgeschlossen ist, wählen Sie Kartusche auswerfen.
- NOTIZ: Die gebrauchte Kartusche einschließlich Durchflusszelle kann bis zum nächsten Lauf, jedoch nicht länger als 3 Tage, an Ort und Stelle belassen werden.
Entfernen Sie die Patrone aus dem Fach.
Entsorgen Sie die Reagenzien gemäß den geltenden Normen.
Wählen Sie Tür schließen. Das Fach wird neu geladen.
Wählen Sie Startseite, um zum Startbildschirm zurückzukehren.
- NOTIZ: Da die Kartusche alle Mechanismen zum Betreiben des Systems sowie einen Behälter zum Sammeln gebrauchter Reagenzien enthält, ist nach dem Lauf keine Instrumentenwäsche erforderlich.

Versionsgeschichte

Version	Datum	Beschreibung
1.0	2021-12-01	Neu

www.olink.com

Nur für Forschungszwecke. Nicht zur Verwendung in diagnostischen Verfahren.

Dieses Produkt enthält eine Lizenz für die nicht-kommerzielle Nutzung von Olink-Produkten. Gewerbliche Benutzer benötigen möglicherweise zusätzliche Lizenzen. Wenden Sie sich für Einzelheiten bitte an Olink Proteomics AB. Es gibt keine ausdrücklichen oder stillschweigenden Garantien, die über diese Beschreibung hinausgehen. Olink Proteomics AB haftet nicht für Sachschäden, Personenschäden oder wirtschaftliche Verluste, die durch dieses Produkt verursacht werden. Die folgende Marke ist Eigentum von Olink Proteomics AB: Olink®. Dieses Produkt ist durch mehrere Patente und Patentanmeldungen geschützt, die unter erhältlich sind https://www.olink.com/patents/.

Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B, SE-752 37 Uppsala, Schweden

1193, v1.0, 2021-12-01

Dokumente / Ressourcen

Olink NextSeq 2000 Explore-Sequenzierungssystem [pdf] Benutzerhandbuch
NextSeq 2000, Explore-Sequenzierungssystem, NextSeq 2000 Explore-Sequenzierungssystem

Verweise

Bedienungsanleitung

Olink NextSeq 2000 Explore-Sequenzierungssystem

Dokumentennotiz

Einführung

Technische Unterstützung

Laboranweisungen

Bereiten Sie Sequenzierungsreagenzien vor

Bereiten Sie die Reagenzienkartusche vor

Bereiten Sie die Durchflusszelle vor

Bereiten Sie die Olink® Library für die Sequenzierung vor

Laden Sie die Fließzelle und die Olink®-Bibliothek in die Reagenzienkartusche

Laden Sie die Fließzelle in die Kartusche

Führen Sie einen Olink®-Sequenzierungslauf durch

Richten Sie Laufparameter ein

Werfen Sie die Kassette nach dem Lauf aus und entsorgen Sie sie

Versionsgeschichte

Dokumente / Ressourcen

Verweise

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