Olink Raziščite zaporedje z uporabo NextSeq 550
Uvod
Namen uporabe
Olink® Explore je platforma za multipleksne imunske teste za odkrivanje biomarkerjev človeških beljakovin. Izdelek je namenjen samo za raziskovalno uporabo in ne za uporabo v diagnostičnih postopkih. Laboratorijsko delo lahko vodi samo usposobljeno laboratorijsko osebje. Obdelavo podatkov lahko izvaja samo usposobljeno osebje. Rezultate naj bi raziskovalci uporabljali v povezavi z drugimi kliničnimi ali laboratorijskimi izvidi.
O tem priročniku
Ta uporabniški priročnik vsebuje navodila, potrebna za zaporedje knjižnic Olink® Explore na Illumina® NextSeq™ 550. Navodila je treba dosledno in izrecno upoštevati. Kakršna koli odstopanja med laboratorijskimi koraki lahko povzročijo oslabljene podatke. Pred začetkom laboratorijskega dela se posvetujte z Olink® Explore Overview Uporabniški priročnik za uvod v platformo, vključno z informacijami o reagentih, potrebni opremi in dokumentaciji, overview poteka dela, kot tudi laboratorijske smernice. Za navodila o tem, kako zagnati komplete reagentov Olink® Explore, glejte ustrezni uporabniški priročnik Olink® Explore. Za obdelavo podatkov in analizo rezultatov zaporedja Olink® Explore glejte Uporabniški priročnik za Olink® MyData Cloud. Vse blagovne znamke in avtorske pravice v tem gradivu so last Olink® Proteomics AB, razen če je navedeno drugače.
Tehnična podpora
Za tehnično podporo se obrnite na Olink Proteomics na support@olink.com.
Laboratorijska navodila
V tem poglavju so navodila za določanje zaporedja knjižnic Olink na NextSeq™ 550 z uporabo kompleta NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 ciklov). Protokol, uporabljen za sekvenciranje, je prilagoditev standardnega poteka dela Illumina® NGS za Illumina® NextSeq™ 550. Preden nadaljujete s sekvenciranjem, se prepričajte, da je bila preverjena kakovost prečiščene knjižnice. Za navodila o nadzoru kakovosti glejte ustrezni uporabniški priročnik Olink Explore.
Načrtujte zaporedje
Eno knjižnico Olink lahko sekvencirate na pretočno celico NextSeq™ 550 High Output in na zagon. Število pretočnih celic z visoko zmogljivostjo in postopkov, potrebnih za zaporedje različnih kompletov reagentov Olink Explore, je opisano v tabeli 1. Če je potrebnih več kot en postopek, ponovite navodila, opisana v tem priročniku.
Tabela 1. Načrtovanje zaporedja:
| Komplet reagentov Olink® Explore | Število knjižnic Olink | Število pretočnih celic in ciklusov |
| Komplet reagentov Olink® Explore 384 | 1 | 1 |
| Komplet reagentov Olink® Explore 4 x 384 | 4 | 4 |
| Komplet reagentov Olink® Explore 1536 | 4 | 4 |
| Komplet reagentov za razširitev Olink® Explore | 4 | 4 |
| Komplet reagentov Olink® Explore 3072 | 8 | 8 |
Namestite Olink® recept po meri
Med tem korakom je recept po meri Olink® nameščen na NextSeq™ 550. Ta korak je treba izvesti samo enkrat, preden se prvič izvede zagon zaporedja Olink.
OPOMBA: Recept po meri Olink bo deloval samo z NextSeq™ 500/550 High Output Kits in NextSeq™ Control Software 4.0
- Razpakirajte in postavite Olinkov recept po meri Olink_NSQ550_HighOutput_V1 v naslednjo mapo instrumenta NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
- V razdelku Prilagajanje sistema > Upravljanje instrumenta omogočite recepte po meri. Če ni izbrana, se možnost recepta po meri ne bo pojavila med nastavitvijo postopka.
OPOMBA: V različici programske opreme NCS 4.0 se bo možnost izbire recepta po meri pojavila šele po nalaganju kartuše z reagentom, ne pa na prejšnji strani z nastavitvami.
OPOMBA: Potek mora biti nastavljen v ročnem načinu, da se omogočijo recepti po meri.
Pripravite reagente za sekvenciranje
Med tem korakom se reagentna kartuša, ki vsebuje reagente za združevanje in sekvenciranje, odmrzne in pripravi pretočno celico.
Pripravite kartušo z reagentom
OPOZORILO: Kartuša z reagentom vsebuje potencialno nevarne kemikalije. Nosite ustrezno zaščitno opremo in zavrzite uporabljene reagente v skladu z veljavnimi standardi. Za več informacij glejte sistemski vodnik Illumina NextSeq 550 (dokument #15069765).
Pripravite klop
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2 (75 ciklov).
Navodila
- Zamrznjeno kartušo z reagentom napol potopite v sobno kaljeno vodo in pustite, da se odtaja 1 uro. Prepričajte se, da so vsi rezervoarji reagenta v kartušah popolnoma odmrznjeni.
OPOMBA: Zaradi udobja odmrznite vložek dan prej in ga hranite čez noč pri 4 °C. Pri tej temperaturi so reagenti stabilni do enega tedna. - Podnožje kartuše temeljito osušite s papirnato brisačo in po potrebi obrišite tesnila folije do suhega z robčkom, ki ne pušča vlaken.
- Kartušo desetkrat obrnite, da temeljito premešate odmrznjene reagente v njej.
- S kartušo nežno potrkajte po mizi, da odstranite zračne mehurčke. Kartušo hranite pri sobni temperaturi, če jo boste uporabili v 4 urah.
Pripravite pretočno celico
Pripravite klop
- 1x NextSeq™ 500/550 visokozmogljiva pretočna celica v2.5.
Navodila
- Ohlajeno pretočno celico segrejte na sobno temperaturo za 30 minut.
- Nadenite si nove rokavice brez pudra (da preprečite kontaminacijo steklene površine pretočne celice).
- Ko ste pripravljeni naložiti pretočno celico v instrument, odstranite pretočno celico iz embalaže in plastičnega ohišja.
- Preglejte pretočno celico. Če so na kateri koli stekleni površini vidni delci ali prah, očistite zadevno površino z robčkom iz izopropilnega alkohola, ki ne pušča vlaken, in jo posušite z laboratorijsko krpo z malo vlaken.
Pripravite knjižnico Olink® za sekvenciranje
Med tem korakom se pripravita razredčitvi NaOH in Tris-HCl, prečiščena in kakovostno kontrolirana knjižnica Olink pa se v zaporednih korakih razredči in denaturira.
Pripravite razredčino NaOH
Razredčitev NaOH se uporablja za denaturacijo knjižnic.
Pripravite klop
- 1 N raztopine NaOH
- Voda MilliQ
- 1x mikrocentrifugalna epruveta (1.5 ml)
- Ročna pipeta (10-100 μL)
- Konice pipete za filter
Preden začnete
Epruveto mikrocentrifuge označite z "NaOH".
Navodila
- Pripravite 0.2 N raztopino NaOH v epruveti NaOH v skladu s tabelo 2.
- Epruveto NaOH temeljito pretresite in zavrtite navzdol. Uporabite v 12 urah.
Tabela 2. 0.2 N razredčitev NaOH
| Reagent | Prostornina (μL) |
| Voda MilliQ | 80 |
| 1 N raztopine NaOH | 20 |
2.4.2 Pripravite razredčino Tris-HCl
Razredčino Tris-HCl uporabimo za nevtralizacijo denaturirane knjižnice.
Pripravite klop
- 1 M zaloga Tris-HCl pH 7.0 (raztopina hidroklorida Trizma®)
- Voda MilliQ
- 1x mikrocentrifugalna epruveta (1.5 ml)
- Ročna pipeta (10-100 μL)
- Konice pipete za filter
Preden začnete
- Označite epruveto mikrocentrifuge "Tris-HCl"
Navodila
- Pripravite 200 mM raztopino Tris-HCl v epruveti Tris-HCl v skladu s tabelo 3.
- Temeljito pretresite cev Tris-HCl in jo zavrtite.
Tabela 3. 200 mM Tris-HCl razredčitev:
| Reagent | Prostornina (μL) |
| Voda MilliQ | 80 |
| 1 M Tris-HCl pH 7.0 zaloga (raztopina Trizma® hidroklorida) | 20 |
Razredčite knjižnice Olink®
Med tem korakom se prečiščena in kakovostno nadzorovana knjižnica Olink razredči v razmerju 1:33.
Pripravite klop
- Lib Tube, pripravljen v skladu z veljavnim uporabniškim priročnikom Olink Explore
- Voda MilliQ
- 1x mikrocentrifugalna epruveta (1.5 ml)
- Ročne pipete (0.5-10 in 100-1000 μL)
- Konice pipete za filter
Preden začnete
- Odtajajte cev Lib, če je zamrznjena.
- Označite novo mikrocentrifugirno epruveto: "Dil".
Navodila
- Dodajte 96 μL vode MilliQ v Dil Tube.
- Vortex Lib Tube in ga na kratko zavrtite navzdol.
- Prenesite 3 μL iz epruvete Lib v epruveto Dil.
- Vortex Dil Tube in ga na kratko zavrtite navzdol
Denaturirajte in razredčite Olink® Library do končne nakladalne koncentracije
Med tem korakom se razredčena knjižnica Olink denaturira in nadalje razredči do končne koncentracije nalaganja.
Pripravite klop
- Dil Tube, pripravljen v prejšnjem koraku
- 0.2 N raztopina NaOH, sveže pripravljena v prejšnjem koraku
- Razredčitev 200 mM Tris-HCl (pH 7.0), pripravljena v prejšnjem koraku
- Hibridizacijski pufer 1 (HT1), vključen v NextSeq™ Accessory Box v2
- 2x mikrocentrifugalne epruvete (1.5 ml in 2 ml)
- Ročne pipete (0.5-10 in 100-1000 μL)
- Konice pipete za filter
Preden začnete
- Zamrznjeni pufer HT1 odmrznite pri sobni temperaturi. Do uporabe hraniti pri +4 °C.
- Označite novo 1.5 ml epruveto za mikrocentrifugo: »Den« (za denaturirano knjižnico).
- Označite novo 2 ml mikrocentrifugirno epruveto: »Seq« (za knjižnico, pripravljeno za nalaganje).
Navodila
- Prenesite 5 μL iz epruvete Dil v epruveto Den.
- Dodajte 5 μL 0.2 N NaOH v Den Tube.
- Vrtinjajte Den Tube in ga na kratko zavrtite.
- Inkubirajte Den Tube 5 minut pri sobni temperaturi, da denaturirate knjižnico.
- Dodajte 5 μL 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) v Den Tube, da nevtralizirate reakcijo.
- Vrtinjajte Den Tube in ga na kratko zavrtite.
- Dodajte 985 μL predhodno ohlajenega HT1 v Den Tube.
- Vrtinjajte Den Tube in ga na kratko zavrtite. Tubo lahko do uporabe (isti dan) shranite pri +4 °C.
- Prenesite 205 μL iz epruvete Den v epruveto Seq.
- V epruveto Seq dodajte 1095 μl predhodno ohlajenega HT1.
- Obrnite epruveto Seq, da premešate reagente, in jo na kratko zavrtite. Končna napolnjena prostornina je 1.3 ml.
- Takoj nadaljujte z 2.5 Izvedite zaporedje Olink®.
Izvedite zaporedje Olink®
Med tem korakom se kartuša s pufrom, pretočna celica in pripravljena kartuša z reagentom, ki vsebuje knjižnico Olink, naložijo v NextSeq 550 in sekvenciranje se začne z uporabo recepta po meri Olink.
Pripravite klop
- Seq Tube (s pripravljeno za nalaganje knjižnice), pripravljeno v prejšnjem koraku
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, pripravljen v prejšnjem koraku
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, pripravljen v prejšnjem koraku
- 1x NextSeq™ 500/550 Puffer Cartridge v2 (75 ciklov), pri sobni temperaturi
Nastavite parametre izvajanja zaporedja
Med tem korakom se na NextSeq™ 550 izberejo parametri zaporedja.
- Na začetnem zaslonu NextSeq™ 550 izberite Preizkus.
- Na zaslonu Select Assay izberite Sequence.
- Na strani Run Setup izberite Manual run mode in nato Next.
- Nastavite parametre delovanja na naslednji način:
- V polje Ime izvajanja vnesite enolični ID poskusa.
- V polje ID knjižnice vnesite ID knjižnice, ki jo izvajate (neobvezno).
- V polju Vrsta branja izberite možnost Eno branje.
- Vnesite število ciklov, kot sledi:
- Preberite 1: 24
- Indeks 1: 0
- Indeks 2: 0
- Preberite 2: 0
- Potrditveno polje za primerke po meri pustite neizbrano.
- Nastavite lokacijo izhodne mape za trenutne neobdelane podatke. Izberite Prebrskaj, da spremenite lokacijo izhodne mape.
- Ne nastavite Sample List.
- Za ta zagon izberite Purge consumables.
- Izberite Naprej.
Naložite pretočno celico v NextSeq™ 550
- Odstranite uporabljeno pretočno celico iz prejšnjega postopka.
- Postavite novo pripravljeno pretočno celico na stage.
- Izberite Naloži. Vrata se samodejno zaprejo.
- Ko se na zaslonu prikaže ID pretočne celice in so senzorji označeni zeleno, izberite Naprej
Izpraznite posodo z reagentom
OPOZORILO: Ta komplet reagentov vsebuje potencialno nevarne kemikalije. Nosite ustrezno zaščitno opremo in zavrzite uporabljene reagente v skladu z veljavnimi standardi. Za več informacij glejte sistemski vodnik Illumina NextSeq 550.
- Odprite vrata vmesnega prostora, odstranite posodo z izrabljenimi reagenti iz spodnjega predelka in odstranite vsebino v skladu z veljavnimi standardi.
- Potisnite prazno posodo za reagent nazaj v spodnji prostor za pufer. Slišen klik pomeni, da je posoda pravilno nameščena.
Naložite kartušo medpomnilnika
- Odstranite uporabljen puferski vložek iz zgornjega prostora za pufer in zavrzite vsebino v skladu z veljavnimi standardi.
- Potisnite nov puferski vložek v zgornji prostor za pufer. Slišen klik pomeni, da je kartuša pravilno nameščena. Prepričajte se, da se ID vmesnega vložka prikaže na zaslonu in da so senzorji označeni zeleno.
- Zaprite vrata predala medpomnilnika in izberite Naprej.
Naložite kartušo z reagentom
- Odprite vrata predelka za reagente, odstranite uporabljeno kartušo z reagentom in zavrzite neuporabljeno vsebino v skladu z veljavnimi standardi. Rezervoar na položaju 6 je odstranljiv, kar omogoča varno odlaganje.
- Preluknjajte tesnilo rezervoarja št. 10 z oznako »Load Library Here« s čisto konico 1 ml pipete.
- Naložite 1.3 ml knjižnice Olink iz epruvete Seq v rezervoar št. 10 z oznako »Naložite knjižnico tukaj«.
- Potisnite novo kartušo z reagentom v predelek za reagente in zaprite vrata predelka za reagente.
- Izberite Naloži in počakajte približno 30 sekund, dokler se na zaslonu ne prikaže ID kartuše z reagentom in so senzorji označeni zeleno.
- Na spustnem seznamu Recept izberite možnost recepta [Po meri] »Olink_NSQ550_HighOutput_V1«.
- Izberite Naprej.
Začnite sekvenciranje
- Potrdite parametre delovanja, prikazane na Review zaslon. Če želite urediti kateri koli parameter, pritisnite Nazaj, da se vrnete na zaslon Run Setup.
- Izberite Naprej. Tek se začne po samodejnem preverjanju pred tekom. Čas delovanja sekvenciranja je približno 7h30 min.
- Očistite delovno območje.
OPOMBA: Ko je postopek sekvenciranja končan, programska oprema sproži samodejno pranje po postopku z uporabo raztopin za pranje, ki so v kartuši s pufrom, in NaOCl, ki je v kartuši z reagentom. To pranje traja približno 90 minut. Gumb Domov postane aktiven, ko je pranje končano. Uporabljene kartuše in pretočno celico lahko pustite na mestu do naslednjega zagona.
Spremljajte napredek teka
Olink uporablja NGS kot odčitek za količinsko opredelitev količine znanega zaporedja, da oceni koncentracijo danega proteina v samples (v primerjavi z drugimi samples). Kakovost podatkov iz vsakega zagona sekvenciranja Explore v glavnem določajo parametri QC, ki so edinstveni za tehnologijo Olink. Zato so standardne metrike nadzora kakovosti, ki se uporabljajo v običajnih NGS, kot je Q-score, manj kritične.
Zgodovina revizij
| Različica | Datum | Opis |
| 1.1 | 2021-12-13 | Uredniške spremembe |
| 1.0 | 2021-12-01 | Novo |
www.olink.com
Samo za raziskovalno uporabo. Ni za uporabo v diagnostičnih postopkih.
Ta izdelek vključuje licenco za nekomercialno uporabo izdelkov Olink. Komercialni uporabniki lahko zahtevajo dodatne licence. Obrnite se na Olink
Proteomics AB za podrobnosti. Ni nobenih jamstev, izrecnih ali implicitnih, ki presegajo ta opis. Olink Proteomics AB ni odgovoren za materialno škodo, telesne poškodbe ali gospodarsko škodo, ki jo povzroči ta izdelek.
Naslednja blagovna znamka je v lasti Olink Proteomics AB: Olink®.
Ta izdelek je zajet v številnih patentih in patentnih prijavah, ki so na voljo na https://www.olink.com/patents/.
© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Vse blagovne znamke tretjih oseb so last njihovih lastnikov. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B, SE-752 37 Uppsala, Švedska
1192, v1.1, 2021-12-13
Dokumenti / Viri
 |
Olink Raziščite zaporedje z uporabo NextSeq 550 [pdfUporabniški priročnik Raziščite zaporedje z uporabo NextSeq 550, Raziščite zaporedje z uporabo NextSeq 550, NextSeq 550 |
