Olink Explore Sequencing usando NextSeq 550
Introdución
Uso previsto
Olink® Explore é unha plataforma de inmunoensaio múltiple para o descubrimento de biomarcadores de proteínas humanas. O produto está destinado só para uso de investigación, e non para uso en procedementos de diagnóstico. O traballo de laboratorio só será realizado por persoal de laboratorio capacitado. O tratamento dos datos só será realizado por persoal capacitado. Os resultados están destinados a ser utilizados polos investigadores en conxunto con outros achados clínicos ou de laboratorio.
Sobre este manual
Este manual de usuario proporciona as instrucións necesarias para secuenciar as bibliotecas Olink® Explore en Illumina® NextSeq™ 550. As instrucións deben seguirse de forma estrita e explícita. Calquera desviación ao longo dos pasos do laboratorio pode producir datos deteriorados. Antes de iniciar o fluxo de traballo do laboratorio, consulte o Olink® Explore Overview Manual de usuario para unha introdución á plataforma, incluíndo información sobre reactivos, equipos e documentación necesaria, e máisview do fluxo de traballo, así como as directrices do laboratorio. Para obter instrucións sobre como executar os kits de reactivos Olink® Explore, consulte o Manual de usuario de Olink® Explore aplicable. Para o procesamento de datos e a análise dos resultados da secuencia de Olink® Explore, consulte a Guía de usuario de Olink® MyData Cloud. Todas as marcas comerciais e dereitos de autor contidos neste material son propiedade de Olink® Proteomics AB, a non ser que se indique o contrario.
Soporte técnico
Para soporte técnico, póñase en contacto con Olink Proteomics en support@olink.com.
Instrucións de laboratorio
Este capítulo ofrece instrucións sobre como secuenciar bibliotecas Olink en NextSeq™ 550 usando o NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 ciclos). O protocolo utilizado para a secuenciación é unha adaptación do fluxo de traballo NGS estándar de Illumina® para Illumina® NextSeq™ 550. Antes de proceder á secuenciación, asegúrese de que se verificou a calidade da biblioteca purificada. Consulte o Manual de usuario de Olink Explore aplicable para obter instrucións sobre o control de calidade.
Planificar a secuenciación
Pódese secuenciar unha biblioteca Olink por célula de fluxo NextSeq™ 550 High Output e por carreira. Na Táboa 1 descríbese o número de celas de fluxo de alto rendemento e series necesarias para secuenciar os diferentes kits de reactivos Olink Explore. Se se precisa máis dunha carreira, repita as instrucións descritas neste manual.
Táboa 1. Planificación de carreiras de secuenciación:
| Kit de reactivos Olink® Explore | Número de bibliotecas Olink | Número de cela(s) de fluxo e carreira(s) |
| Kit de reactivos Olink® Explore 384 | 1 | 1 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 4 x 384 | 4 | 4 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 1536 | 4 | 4 |
| Kit de reactivos de expansión Olink® Explore | 4 | 4 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 3072 | 8 | 8 |
Instala a receita personalizada Olink®
Durante este paso, a receita personalizada Olink® instálase no NextSeq™ 550. Este paso só debe realizarse unha vez, antes de realizar unha secuencia de secuencias Olink por primeira vez.
NOTA: A receita personalizada de Olink só funcionará cos kits de alta saída NextSeq™ 500/550 e o software de control NextSeq™ 4.0
- Descomprima e coloque a receita personalizada Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 no seguinte cartafol do instrumento NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
- En Personalización do sistema > Xestionar instrumento, habilite Receitas personalizadas. Se non se selecciona, a opción de receita personalizada non aparecerá durante a configuración da execución.
NOTA: Na versión de software NCS 4.0, a opción de seleccionar unha receita personalizada só se producirá despois de que se cargue o cartucho de reactivo, non na páxina de configuración anterior.
NOTA: A execución debe configurarse en modo manual para permitir receitas personalizadas.
Preparar reactivos de secuenciación
Durante este paso, descongélase o cartucho de reactivos que contén os reactivos de agrupación e secuenciación e prepárase a célula de fluxo.
Prepare o cartucho de reactivos
AVISO: O cartucho de reactivos contén produtos químicos potencialmente perigosos. Use o equipo de protección adecuado e descarte os reactivos usados de acordo coas normas aplicables. Para obter máis información, consulte a Guía do sistema Illumina NextSeq 550 (documento #15069765).
Prepara o banco
- 1 cartucho de reactivos de alta saída NextSeq™ 500/550 v2 (75 ciclos).
Instrucións
- Coloque o cartucho de reactivo conxelado medio mergullado en auga temperada e déixao desconxelar durante 1 hora. Asegúrese de que todos os depósitos de reactivos dos cartuchos estean completamente desconxelados.
NOTA: Para maior comodidade, desconxela o cartucho o día anterior e gárdao durante a noite a 4 °C. A esta temperatura, os reactivos son estables ata unha semana. - Seque a base do cartucho ben cunha toalla de papel e seque os selos de folla cun pano sen pelusa se é necesario.
- Inverte o cartucho dez veces para mesturar ben os reactivos descongelados.
- Toque suavemente o cartucho no banco para eliminar as burbullas de aire. Almacene o cartucho a temperatura ambiente se se usa dentro de 4 horas.
Preparar a célula de fluxo
Prepara o banco
- 1x NextSeq™ 500/550 Célula de fluxo de alto rendemento v2.5.
Instrucións
- Leve a célula de fluxo refrixerada a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Poñer luvas novas sen po (para evitar contaminar a superficie de vidro da célula de fluxo).
- Cando estea listo para cargar a célula de fluxo no instrumento, retire a célula de fluxo do paquete e a carcasa de plástico.
- Inspeccione a célula de fluxo. Se hai partículas ou po en calquera das superficies de vidro, limpe a superficie aplicable cunha toallita de alcohol isopropílico sen pelusa e séquea cun pano de laboratorio sen pelusa.
Prepare a biblioteca Olink® para a secuenciación
Durante este paso, prepáranse dilucións de NaOH e Tris-HCl, e a biblioteca Olink purificada e de calidade controlada dilúese e desnaturalízase en pasos secuenciais.
Prepare a dilución de NaOH
A dilución de NaOH úsase para desnaturalizar as bibliotecas.
Prepara o banco
- Stock de NaOH 1 N
- Auga MilliQ
- 1x tubo de microcentrífuga (1.5 ml)
- Pipeta manual (10-100 μL)
- Puntas de pipeta con filtro
Antes de comezar
Marque o tubo de microcentrífuga "NaOH".
Instrucións
- Prepare unha dilución de NaOH 0.2 N no tubo de NaOH segundo a táboa 2.
- Agitar o tubo de NaOH completamente e xirar cara abaixo. Use dentro de 12 horas.
Táboa 2. Dilución de NaOH 0.2 N
| Reactivo | Volume (μl) |
| Auga MilliQ | 80 |
| Stock de NaOH 1 N | 20 |
2.4.2 Preparar a dilución de Tris-HCl
A dilución de Tris-HCl úsase para neutralizar a Biblioteca desnaturalizada.
Prepara o banco
- stock 1 M de Tris-HCl pH 7.0 (solución de clorhidrato de Trizma®)
- Auga MilliQ
- 1x tubo de microcentrífuga (1.5 ml)
- Pipeta manual (10-100 μL)
- Puntas de pipeta con filtro
Antes de comezar
- Marque o tubo de microcentrífuga "Tris-HCl"
Instrucións
- Prepare unha dilución de 200 mM de Tris-HCl no tubo de Tris-HCl segundo a táboa 3.
- Agitar o tubo Tris-HCl completamente e xiralo cara abaixo.
Táboa 3. Dilución de Tris-HCl 200 mM:
| Reactivo | Volume (μl) |
| Auga MilliQ | 80 |
| Tris-HCl 1M pH 7.0 (solución de hidrocloruro de Trizma®) | 20 |
Diluír bibliotecas Olink®
Durante este paso, a biblioteca Olink purificada e controlada de calidade dilúese 1:33.
Prepara o banco
- Lib Tube, preparado segundo o Manual de usuario de Olink Explore aplicable
- Auga MilliQ
- 1x tubo de microcentrífuga (1.5 ml)
- Pipetas manuais (0.5-10 e 100-1000 μL)
- Puntas de pipeta con filtro
Antes de comezar
- Desconxelar o tubo Lib se está conxelado.
- Marque o novo tubo de microcentrífuga: "Dil".
Instrucións
- Engade 96 μL de auga MilliQ ao tubo Dil.
- Agitar o tubo Lib e xiralo brevemente.
- Transfira 3 μl do tubo Lib ao tubo Dil.
- Agitar o tubo Dil e xiralo brevemente
Desnaturalizar e diluír Olink® Library ata a concentración de carga final
Durante este paso, a biblioteca Olink diluída é desnaturalizada e dilúese aínda máis ata a concentración de carga final.
Prepara o banco
- Dil Tube, preparado no paso anterior
- Dilución de NaOH 0.2 N, recentemente preparada no paso anterior
- Dilución 200 mM de Tris-HCl (pH 7.0), preparada no paso anterior
- Buffer de hibridación 1 (HT1) incluído na caixa de accesorios NextSeq™ v2
- 2x tubos de microcentrífuga (1.5 ml e 2 ml)
- Pipetas manuais (0.5-10 e 100-1000 μL)
- Puntas de pipeta con filtro
Antes de comezar
- Desconxelar o tampón HT1 conxelado a temperatura ambiente. Almacenar a +4 °C ata o seu uso.
- Marque o novo tubo de microcentrífuga de 1.5 ml: "Den" (para a biblioteca desnaturalizada).
- Marque o novo tubo de microcentrífuga de 2 ml: "Seq" (para a biblioteca lista para cargar).
Instrucións
- Transfira 5 μl do tubo Dil ao tubo Den.
- Engade 5 μL de NaOH 0.2 N ao tubo Den.
- Agitar o Den Tube e xiralo brevemente.
- Incube o Den Tube durante 5 minutos a temperatura ambiente para desnaturalizar a Biblioteca.
- Engade 5 μl de Tris-HCl 200 mM (pH 7.0) ao tubo Den para neutralizar a reacción.
- Agitar o Den Tube e xiralo brevemente.
- Engade 985 μL de HT1 preenfriado ao Den Tube.
- Agitar o Den Tube e xiralo brevemente. O tubo pódese almacenar a +4 °C ata o seu uso (o mesmo día).
- Transfira 205 μl do tubo Den ao tubo Seq.
- Engade 1095 μl de HT1 preenfriado ao tubo Seq.
- Inverte o tubo Seq para mesturar os reactivos e xiralo brevemente. O volume de carga final é de 1.3 ml.
- Continúe inmediatamente a 2.5 Realizar a execución de secuenciación Olink®.
Realice a execución de secuenciación Olink®
Durante este paso, o cartucho de tampón, a célula de fluxo e o cartucho de reactivo preparado que contén a biblioteca Olink cárganse no NextSeq 550 e iníciase a execución de secuenciación utilizando a receita personalizada de Olink.
Prepara o banco
- Seq Tube (con biblioteca lista para cargar), preparado no paso anterior
- 1 cartucho de reactivo de alta saída NextSeq™ 500/550 v2, preparado no paso anterior
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, preparada no paso anterior
- 1 cartucho tampón NextSeq™ 500/550 v2 (75 ciclos), a temperatura ambiente
Configurar os parámetros de secuenciación
Durante este paso, os parámetros de secuenciación son seleccionados no NextSeq™ 550.
- Na pantalla de inicio do NextSeq™ 550, seleccione Experimento.
- Na pantalla Seleccionar ensaio, seleccione Secuencia.
- Na páxina de configuración de execución, seleccione Modo de execución manual e despois Seguinte.
- Configure os parámetros de execución do seguinte xeito:
- No campo Nome da execución, introduza un ID de experimento único.
- No campo ID da biblioteca, introduza o ID da biblioteca que está a executar (opcional).
- No campo Tipo de lectura, seleccione a opción Lectura única.
- Introduza o número de ciclos do seguinte xeito:
- Lectura 1: 24
- Índice 1: 0
- Índice 2: 0
- Lectura 2: 0
- Manteña a caixa de verificación para cebadores personalizados sen seleccionar.
- Establece a localización do cartafol de saída para os datos en bruto da execución actual. Seleccione Examinar para cambiar a localización do cartafol de saída.
- Non configure un Sample Folla.
- Seleccione Purgar consumibles para esta execución.
- Seleccione Seguinte.
Cargue a cela de fluxo en NextSeq™ 550
- Elimina a cela de fluxo usada da execución anterior.
- Coloque a nova cela de fluxo preparada no stage.
- Seleccione Cargar. A porta péchase automaticamente.
- Cando o ID da cela de fluxo apareza na pantalla e os sensores estean marcados en verde, seleccione Seguinte
Baleirar o recipiente de reactivos
AVISO: Este conxunto de reactivos contén produtos químicos potencialmente perigosos. Use o equipo de protección adecuado e descarte os reactivos usados de acordo coas normas aplicables. Para obter máis información, consulte a Guía do sistema Illumina NextSeq 550.
- Abra a porta do compartimento tampón, retire o recipiente de reactivos gastados do compartimento inferior e elimine o contido de acordo coas normas aplicables.
- Deslice o recipiente de reactivo baleiro de novo no compartimento inferior do tampón. Un clic audible indica que o recipiente está colocado correctamente.
Cargar o cartucho do buffer
- Retire o cartucho tampón usado do compartimento tampón superior e elimine o contido de acordo coas normas aplicables.
- Deslice un cartucho de búfer novo no compartimento superior do búfer. Un clic audible indica que o cartucho está colocado correctamente. Asegúrese de que o ID do cartucho de memoria intermedia aparece na pantalla e de que os sensores están marcados en verde.
- Pecha a porta do compartimento tampón e selecciona Seguinte.
Cargar cartucho de reactivo
- Abra a porta do compartimento de reactivos, retire o cartucho de reactivo usado e elimine o contido non utilizado de acordo coas normas aplicables. O depósito na posición 6 é extraíble para facilitar a eliminación segura.
- Perfore o selo do depósito número 10 etiquetado como "Cargar biblioteca aquí" cunha punta de pipeta limpa de 1 ml.
- Cargue 1.3 ml da biblioteca Olink do tubo Seq no depósito nº 10 etiquetado como "Cargar biblioteca aquí".
- Deslice o cartucho de reactivos novo no compartimento de reactivos e peche a porta do compartimento de reactivos.
- Seleccione Cargar e agarde ~30 segundos ata que o ID do cartucho de reactivos apareza na pantalla e os sensores se marquen en verde.
- Na lista despregable Receita, seleccione a opción de receita [Personalizada] "Olink_NSQ550_HighOutput_V1".
- Seleccione Seguinte.
Comeza a secuenciación
- Confirme os parámetros de execución que aparecen no Review pantalla. Para editar calquera parámetro, prema Atrás para volver á pantalla Run Setup.
- Seleccione Seguinte. A carreira comeza despois dunha comprobación automática previa. O tempo de execución da secuenciación é de aproximadamente 7h30 min.
- Limpar a zona de traballo.
NOTA: Cando se completa a secuenciación, o software inicia un lavado automático posterior utilizando as solucións de lavado proporcionadas no cartucho tampón e o NaOCl que se proporciona no cartucho de reactivo. Este lavado leva aproximadamente 90 minutos. O botón Inicio activarase unha vez que se complete o lavado. Os cartuchos usados e a célula de fluxo pódense deixar no seu lugar ata a próxima execución.
Supervisar o progreso da execución
Olink usa NGS como lectura para cuantificar a cantidade dunha secuencia coñecida co fin de estimar a concentración dunha determinada proteína en samples (relativo a outros samples). A calidade dos datos de cada execución de secuenciación Explore está determinada principalmente por parámetros de control de calidade exclusivos da tecnoloxía Olink. Polo tanto, as métricas estándar de control de calidade utilizadas nos NGS convencionais, como o Q-score, son menos críticas.
Historial de revisións
| Versión | Data | Descrición |
| 1.1 | 2021-12-13 | Cambios editoriais |
| 1.0 | 2021-12-01 | Novo |
www.olink.com
Só para uso de investigación. Non para o seu uso en procedementos de diagnóstico.
Este produto inclúe unha licenza para o uso non comercial dos produtos Olink. Os usuarios comerciais poden requirir licenzas adicionais. Póñase en contacto con Olink
Proteomics AB para máis detalles. Non hai garantías, expresas ou implícitas, que estean máis aló desta descrición. Olink Proteomics AB non se fai responsable dos danos materiais, danos persoais ou da perda económica causados por este produto.
A seguinte marca comercial é propiedade de Olink Proteomics AB: Olink®.
Este produto está cuberto por varias patentes e solicitudes de patentes dispoñibles en https://www.olink.com/patents/.
© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Todas as marcas comerciais de terceiros son propiedade dos seus respectivos propietarios. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Suecia
1192, v1.1, 2021-12-13
Documentos/Recursos
 |
Olink Explore Sequencing usando NextSeq 550 [pdfManual do usuario Explore a secuenciación usando NextSeq 550, Explore a secuenciación, usando NextSeq 550, NextSeq 550 |
