Olink NextSeq 550 Explore Sequencing

Poznámka k dokumentu

Uživatelská příručka Olink® Explore, dokument č. 1153, je zastaralá a byla nahrazena následujícími dokumenty:

• Olink® Explore Overview Uživatelská příručka, dokument č. 1187
• Uživatelská příručka Olink® Explore 384, dokument č. 1188
• Uživatelská příručka Olink® Explore 4 x 384, dokument č. 1189
• Uživatelská příručka Olink® Explore 1536 & Expansion, dokument č. 1190
• Uživatelská příručka Olink® Explore 3072, dokument č. 1191
• Olink® Explore Sequencing using NextSeq 550 User Manual, doc nr 1192
• Olink® Explore Sequencing using NextSeq 2000 User Manual, doc nr 1193
• Olink® Explore Sequencing using NovaSeq 6000 User Manual, doc nr 1194

Zavedení

Zamýšlené použití

Olink® Explore je platforma multiplexního imunotestu pro objevování biomarkerů lidských proteinů. Produkt je určen pouze pro výzkumné použití, nikoli pro použití v diagnostických postupech. Laboratorní práce smí provádět pouze vyškolený laboratorní personál. Zpracování dat smí provádět pouze vyškolený personál. Výsledky jsou určeny pro použití výzkumníky ve spojení s jinými klinickými nebo laboratorními nálezy.

O tomto návodu

Tato uživatelská příručka poskytuje pokyny potřebné k sekvenčnímu řazení knihoven Olink® Explore na Illumina® NextSeq™ 550. Pokyny musí být přísně a výslovně dodržovány. Jakékoli odchylky v průběhu laboratorních kroků mohou vést ke zhoršení dat. Před zahájením laboratorního pracovního postupu si prostudujte Olink® Explore Overview Uživatelská příručka pro úvod do platformy, včetně informací o reagenciích, potřebném vybavení a dokumentaci, konecview pracovního postupu a také laboratorních pokynů. Pokyny, jak používat reagenční sady Olink® Explore, naleznete v příslušné uživatelské příručce Olink® Explore. Pro zpracování dat a analýzu výsledků sekvence Olink® Explore viz Uživatelská příručka Olink® NPX Explore. Všechny ochranné známky a autorská práva obsažená v tomto materiálu jsou majetkem společnosti Olink® Proteomics AB, pokud není uvedeno jinak.

Technická podpora

Pro technickou podporu kontaktujte Olink Proteomics na adrese podpora@olink.com.

Laboratorní instrukce

Tato kapitola poskytuje pokyny, jak sekvenovat knihovny Olink na NextSeq™ 550 pomocí NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cyklů). Protokol použitý pro sekvenování je adaptací standardního pracovního postupu NGS Illumina® pro Illumina® NextSeq™ 550. Než přistoupíte k sekvenování, ujistěte se, že byla ověřena kvalita vyčištěné knihovny. Pokyny týkající se kontroly kvality naleznete v příslušné uživatelské příručce Olink Explore.

Naplánujte běh sekvenování

Jedna knihovna Olink může být sekvenována na průtokovou kyvetu NextSeq™ 550 High Output a na běh. Počet průtokových kyvet a cyklů s vysokým výstupem potřebných k sekvenování různých reagenčních souprav Olink Explore je popsán v tabulce 1. Pokud je zapotřebí více než jeden běh, zopakujte pokyny popsané v této příručce.

Tabulka 1. Plánování běhu sekvenování

Reagenční sada Olink® Explore	Počet knihoven Olink	Počet průtokových buněk a běhů
Reagenční sada Olink® Explore 384	1	1
Reagenční sada Olink® Explore 4 x 384	4	4
Reagenční sada Olink® Explore 1536	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Reagenční sada Olink® Explore 3072	8	8

Nainstalujte si vlastní recepturu Olink®

Během tohoto kroku je na NextSeq™ 550 nainstalován vlastní recept Olink®. Tento krok je třeba provést pouze jednou, než se poprvé provede sekvenování Olink.

POZNÁMKA: Vlastní receptura Olink bude fungovat pouze s NextSeq™ 500/550 High Output Kit a NextSeq™ Control Software 4.0.

1. Rozbalte a umístěte vlastní recept Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 do následující složky přístroje NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
2. V části Přizpůsobení systému > Spravovat nástroj povolte Vlastní receptury. Pokud není vybrána, možnost vlastního receptu se během nastavování běhu nezobrazí.

POZNÁMKA

• Ve verzi softwaru NCS 4.0 se možnost výběru vlastního receptu objeví pouze po vložení kazety s reagenciemi, nikoli na předchozí stránce nastavení.
• Běh musí být nastaven v manuálním režimu, aby bylo možné vytvářet vlastní recepty.

Připravte sekvenační činidla

Během tohoto kroku se kazeta s reagenciemi obsahující shlukovací a sekvenační činidla rozmrazí a připraví se průtoková cela.

Připravte kazetu s reagenciemi

VAROVÁNÍ: Zásobník s reagenciemi obsahuje potenciálně nebezpečné chemikálie. Používejte vhodné ochranné prostředky a použité reagencie zlikvidujte v souladu s platnými normami. Další informace naleznete v Průvodci systémem Illumina NextSeq 550 (dokument č. 15069765).

Připravte lavici

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2 (75 cyklů).

Instrukce

1. Umístěte kazetu se zmrazeným činidlem napůl ponořenou do vody temperované na pokoj a nechte ji 1 hodinu rozmrazit. Ujistěte se, že všechny zásobníky reagencií kazet jsou zcela rozmrazené.
   • POZNÁMKA: Pro usnadnění rozmrazte kazetu den předem a uložte ji přes noc při 4 °C. Při této teplotě jsou reagencie stabilní po dobu jednoho týdne.
2. Důkladně osušte základnu kazety papírovou utěrkou a v případě potřeby osušte těsnění fólií utěrkou, která nepouští vlákna.
3. Desetkrát otočte kazetu, aby se rozmražená činidla důkladně promíchala.
4. Jemně poklepejte kazetou o stůl, abyste odstranili vzduchové bubliny. Pokud bude kazeta použita do 4 hodin, skladujte ji při pokojové teplotě.

Připravte průtokovou celu

Připravte lavici

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5.

Instrukce

1. Přiveďte chlazenou průtokovou celu na pokojovou teplotu po dobu 30 minut.
2. Nasaďte si nové rukavice bez pudru (aby nedošlo ke kontaminaci skleněného povrchu průtokové cely).
3. Až budete připraveni vložit průtokovou kyvetu do přístroje, vyjměte průtokovou kyvetu z obalu a plastové pouzdro.
4. Zkontrolujte průtokovou kyvetu. Pokud jsou na některém ze skleněných povrchů viditelné částice nebo prach, očistěte příslušný povrch utěrkou s izopropylalkoholem, která nepouští vlákna, a osušte jej laboratorním kapesníčkem, který nepouští vlákna.

Připravte Olink® Library pro sekvenování

Během tohoto kroku se připraví ředění NaOH a Tris-HCl a vyčištěná a kvalitativně kontrolovaná knihovna Olink Library se ředí a denaturuje v postupných krocích.

Připravte ředění NaOH

• Ředění NaOH se používá k denaturaci knihoven.

Připravte lavici

• 1N zásobní roztok NaOH
• MilliQ voda
• 1x mikrocentrifugační zkumavka (1.5 ml)
• Ruční pipeta (10–100 μL)
• Filtrujte špičky pipet

Než začnete

• Označte zkumavku pro mikrocentrifugu „0.2 N NaOH“.

Instrukce

1. Připravte 0.2N ředění NaOH ve zkumavce 0.2N NaOH podle tabulky 2.
2. Zkumavku 0.2 N NaOH důkladně promíchejte na vortexu a otočte dolů. Spotřebujte do 12 hodin.

Tabulka 2. Ředění 0.2 N NaOH

Činidlo	Objem (μL)
MilliQ voda	80
1N zásobní roztok NaOH	20

Připravte ředění Tris-HCl

• K neutralizaci denaturované knihovny se používá ředění Tris-HCl.

Připravte lavici

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 zásobní roztok (Trizma® hydrochloridový roztok)
• MilliQ voda
• 1x mikrocentrifugační zkumavka (1.5 ml)
• Ruční pipeta (10–100 μL)
• Filtrujte špičky pipet

Než začnete

• Označte mikrocentrifugační zkumavku „Tris-HCl“

Instrukce

1. Připravte 200 mM ředění Tris-HCl ve zkumavce Tris-HCl podle tabulky 3.
2. Důkladně vortexujte zkumavku Tris-HCl a otočte ji dolů.

Tabulka 3. Zředění 200 mM Tris-HCl

Činidlo	Objem (μL)
MilliQ voda	80
1M zásobní roztok Tris-HCl pH 7.0 (Trizma® hydrochloridový roztok)	20

Zřeďte knihovny Olink®

• Během tohoto kroku se vyčištěná a kvalitativně kontrolovaná knihovna Olink zředí v poměru 1:33.

Připravte lavici

• Lib Tube, připravená podle příslušné uživatelské příručky Olink Explore
• MilliQ voda
• 1x mikrocentrifugační zkumavka (1.5 ml)
• Ruční pipety (0.5–10 a 100–1000 μl)
• Filtrujte špičky pipet

Než začnete

• Rozmrazte Lib Tube, pokud je zmrazená.
• Označte novou mikrocentrifugační zkumavku: „Dil“.

Instrukce

1. Přidejte 96 μl vody MilliQ do zkumavky Dil.
2. Vortexujte Lib Tube a krátce ji roztočte.
3. Přeneste 3 μl z Lib Tube do Dil Tube.
4. Vortexujte Dil Tube a krátce ji otočte dolů.

POZNÁMKA: Uchovávejte Lib Tube(y) při -20 °C pro případ možného opětovného spuštění.

Denaturujte a nařeďte Olink® Library na konečnou nakládací koncentraci

Během tohoto kroku je zředěná knihovna Olink denaturována a dále zředěna na konečnou nanášecí koncentraci.

Připravte lavici

• Dil Tube, připravený v předchozím kroku
• 0.2N ředění NaOH, čerstvě připravené v předchozím kroku
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) ředění, připravené v předchozím kroku
• Hybridizační pufr 1 (HT1) součástí NextSeq™ Accessory Box v2
• 2x mikrocentrifugační zkumavky (1.5 ml a 2 ml)
• Ruční pipety (0.5–10 a 100–1000 μl)
• Filtrujte špičky pipet

Než začnete

• Rozmrazte zmrazený HT1 pufr při pokojové teplotě. Do použití skladujte při +4 °C.
• Označte novou 1.5ml mikrocentrifugační zkumavku: „Den“ (pro denaturovanou knihovnu).
• Označte novou 2ml mikrocentrifugační zkumavku: „Seq“ (pro knihovnu připravenou k načtení).

Instrukce

1. Přeneste 5 μl z Dil Tube do Den Tube.
2. Přidejte 5 μl 0.2 N NaOH do Den Tube.
3. Vortexujte Den Tube a krátce ji roztočte.
4. Inkubujte Den Tube po dobu 5 minut při pokojové teplotě, aby se knihovna denaturovala.
5. Přidejte 5 μl 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) do Den Tube, abyste neutralizovali reakci.
6. Vortexujte Den Tube a krátce ji roztočte.
7. Přidejte 985 μl předchlazeného HT1 do Den Tube.
8. Vortexujte Den Tube a krátce ji roztočte. Zkumavku lze skladovat při +4 °C až do použití (tentýž den).
9. Přeneste 205 μl z Den Tube do Seq Tube.
10. Přidejte 1095 μl předchlazeného HT1 do zkumavky Seq.
11. Otočte zkumavku Seq, aby se reagencie promíchaly, a krátce ji odstřeďte. Konečný nakládací objem je 1.3 ml.
12. Okamžitě pokračujte na 2.5 Proveďte sekvenační běh Olink®.

Proveďte sekvenační běh Olink®

Během tohoto kroku se kazeta s pufrem, průtoková kyveta a připravená kazeta s reagenciemi obsahující knihovnu Olink vloží do NextSeq 550 a spustí se sekvenování s použitím vlastní receptury Olink.

Připravte lavici

• Seq Tube (s knihovnou připravenou k načtení), připravená v předchozím kroku
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, připravená v předchozím kroku
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, připravený v předchozím kroku
• 1x zásobník NextSeq™ 500/550 Buffer Cartridge v2 (75 cyklů), při pokojové teplotě

Nastavte parametry běhu sekvenování

Během tohoto kroku se na NextSeq™ 550 vyberou parametry běhu sekvenování.

1. Na domovské obrazovce NextSeq™ 550 vyberte Experiment.
2. Na obrazovce Select Assay vyberte Sequence.
3. Na stránce Run Setup vyberte Manual run mode a poté Next.
4. Parametry běhu nastavte takto:
   • Do pole Run Name zadejte jedinečné ID experimentu.
   • Do pole ID knihovny zadejte ID knihovny, kterou provozujete (volitelné).
   • V poli Typ čtení vyberte možnost Jedno čtení.
   • Zadejte počet cyklů následovně:
     • Přečtěte si 1: 24
     • Index 1: 0
     • Index 2: 0
     • Přečtěte si 2: 0
     • DŮLEŽITÉ: Je důležité, aby Read 1 bylo nastaveno na 24, jinak celý běh selže.
   • Nechte zaškrtávací políčko pro vlastní primery nezaškrtnuté.
   • Nastavte umístění výstupní složky pro aktuální nezpracovaná data. Chcete-li změnit umístění výstupní složky, vyberte Procházet.
5. Nenastavujte Sample List.
6. Pro tento běh vyberte možnost Vyčistit spotřební materiál.
7. Vyberte Další.

Vložte průtokovou kyvetu do NextSeq™ 550

1. Odstraňte použitou průtokovou kyvetu z předchozího běhu.
2. Umístěte novou připravenou průtokovou celu na stage.
3. Vyberte Načíst. Dveře se automaticky zavřou.
4. Když se na obrazovce objeví ID průtokové cely a senzory jsou zkontrolovány zeleně, vyberte Další.

Vyprázdněte nádobu na činidlo

VAROVÁNÍ: Tato sada činidel obsahuje potenciálně nebezpečné chemikálie. Používejte vhodné ochranné prostředky a použité reagencie zlikvidujte v souladu s platnými normami. Další informace naleznete v Průvodci systémem Illumina NextSeq 550.

1. Otevřete dvířka přihrádky na pufr, vyjměte nádobku s použitými reagenciemi ze spodní přihrádky a obsah zlikvidujte v souladu s platnými normami.
2. Zasuňte prázdnou nádobu s reagenciemi zpět do spodní přihrádky na pufr. Slyšitelné cvaknutí signalizuje, že nádoba je správně umístěna.

Naplňte zásobník pufru

1. Vyjměte použitou kazetu s pufrem z horní komory pro pufr a obsah zlikvidujte v souladu s platnými normami.
2. Zasuňte novou kazetu s pufrem do horní přihrádky na pufr. Slyšitelné cvaknutí signalizuje, že je kazeta správně umístěna. Ujistěte se, že se na obrazovce objeví ID kazety s vyrovnávací pamětí a že jsou senzory zaškrtnuté zeleně.
3. Zavřete dvířka vyrovnávací přihrádky a zvolte Další.

Vložte kazetu s reagenciemi

1. Otevřete dvířka reagenční přihrádky, vyjměte použitou reagenční kazetu a nepoužitý obsah zlikvidujte v souladu s platnými normami. Zásobník na pozici 6 je odnímatelný pro usnadnění bezpečné likvidace.
2. Propíchněte těsnění zásobníku č. 10 označeného jako „Load Library Here“ čistou špičkou 1 ml pipety.
3. Vložte 1.3 ml knihovny Olink ze zkumavky Seq do zásobníku č. 10 označeného jako „Load Library Here“.
4. Zasuňte novou reagenční kazetu do reagenčního prostoru a zavřete dvířka reagenčního prostoru.
5. Vyberte Load a počkejte ~30 sekund, dokud se na obrazovce nezobrazí ID kazety s reagenciemi a senzory se zkontrolují zeleně.
6. Z rozevíracího seznamu Recipe vyberte možnost [Vlastní] recept „Olink_NSQ550_HighOutput_V1“.
   • DŮLEŽITÉ: Ujistěte se, že uživatelská receptura byla dříve v přístroji nainstalována. Viz 2.2 Instalace vlastního receptu Olink®.
7. Vyberte Další.

1. Potvrďte parametry běhu zobrazené na Review obrazovka. Chcete-li upravit jakékoli parametry, stiskněte tlačítko Zpět pro návrat na obrazovku Run Setup.
2. Vyberte Další. Jízda se spustí po automatické kontrole před spuštěním. Doba běhu sekvenování je přibližně 7 hodin 30 minut.
3. DŮLEŽITÉ: Ujistěte se, že běh začíná po dokončení automatické kontroly před spuštěním (~5 minut).
   1. POZNÁMKAV případě jakýchkoli selhání kontroly před spuštěním se řiďte pokyny výrobce.
   2. POZNÁMKA: Dávejte pozor, abyste nenarazili nebo jinak nenarušili NextSeq™ 550 během sekvenování. Přístroj je citlivý na vibrace.
4. Vyčistěte pracovní plochu.
   1. POZNÁMKA: Když je sekvenování dokončeno, software zahájí automatické promývání po běhu s použitím promývacích roztoků dodávaných v kazetě s pufrem a NaOCl dodávaného v kazetě s reagenciemi. Toto mytí trvá přibližně 90 minut. Tlačítko Domů se aktivuje po dokončení mytí. Použité kazety a průtoková cela mohou být ponechány na místě až do dalšího běhu.

Sledujte průběh běhu

Olink používá NGS jako výstup ke kvantifikaci množství známé sekvence, aby mohl odhadnout koncentraci daného proteinu v samples (ve vztahu k jiným samples). Kvalita dat z každého běhu sekvenování Explore je určena především parametry QC jedinečnými pro technologii Olink. Standardní metriky kontroly kvality používané v konvenčních NGS, jako je Q-score, jsou tedy méně kritické.

Historie revizí

Verze	Datum	Popis
1.2	2022-11-01	1.2 Olink® Mydata nahrazen Olink® NPX Explore. 2.4 Přidáno 0.2 N k Než začnete.
1.1	2021-12-13	Redakční změny
1.0	2021-12-01	Nový

www.olink.com

Pouze pro výzkumné použití. Není určeno pro diagnostické postupy.

Tento produkt zahrnuje licenci pro nekomerční použití produktů Olink. Komerční uživatelé mohou vyžadovat další licence. Podrobnosti vám sdělí společnost Olink Proteomics AB. Neexistují žádné záruky, vyjádřené nebo předpokládané, které přesahují tento popis. Společnost Olink Proteomics AB nenese odpovědnost za škody na majetku, zranění osob nebo ekonomické ztráty způsobené tímto produktem. Následující ochranná známka je majetkem společnosti Olink Proteomics AB: Olink®. Na tento produkt se vztahuje několik patentů a patentových přihlášek dostupných na adrese https://www.olink.com/patents/.

© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Všechny ochranné známky třetích stran jsou majetkem příslušných vlastníků.
Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Švédsko
1192, v1.2, 2022-11-01

Dokumenty / zdroje

Olink NextSeq 550 Explore Sequencing [pdfUživatelská příručka NextSeq 550 Explore Sequencing, NextSeq 550, Explore Sequencing, Sequencing

Reference

• Uživatelská příručka