Olink Explore Sequencing koristeći NextSeq 550

Uvod

Namjena
Olink® Explore je multipleksna platforma za imunotestiranje za otkrivanje biomarkera humanih proteina. Proizvod je namijenjen samo za istraživačku upotrebu, a ne za upotrebu u dijagnostičkim procedurama. Laboratorijski rad će voditi samo obučeno laboratorijsko osoblje. Obradu podataka vrši samo obučeno osoblje. Rezultati su namijenjeni da ih istraživači koriste u kombinaciji s drugim kliničkim ili laboratorijskim nalazima.

O ovom priručniku
Ovaj korisnički priručnik pruža uputstva potrebna za sekvencioniranje Olink® Explore biblioteka na Illumina® NextSeq™ 550. Uputstva se moraju striktno i eksplicitno slijediti. Bilo kakva odstupanja u laboratorijskim koracima mogu dovesti do umanjenih podataka. Prije pokretanja laboratorijskog toka rada, konsultujte Olink® Explore Overview Korisnički priručnik za uvod u platformu, uključujući informacije o reagensima, opremi i potrebnoj dokumentaciji, prekoview toka rada, kao i laboratorijske smjernice. Za uputstva o tome kako da pokrenete Olink® Explore komplete reagensa, pogledajte odgovarajući Olink® Explore korisnički priručnik. Za obradu podataka i analizu rezultata sekvence Olink® Explore, pogledajte Olink® MyData Cloud korisnički vodič. Svi zaštitni znakovi i autorska prava sadržana u ovom materijalu vlasništvo su Olink® Proteomics AB, osim ako nije drugačije navedeno.

Tehnička podrška
Za tehničku podršku kontaktirajte Olink Proteomics na support@olink.com.

Laboratorijske upute

Ovo poglavlje pruža upute o tome kako sekvencirati Olink biblioteke na NextSeq™ 550 koristeći NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 ciklusa). Protokol koji se koristi za sekvenciranje je adaptacija Illumina® standardnog NGS radnog toka za Illumina® NextSeq™ 550. Prije nego što nastavite s sekvenciranjem, uvjerite se da je kvalitet pročišćene biblioteke potvrđen. Pogledajte primjenjivi korisnički priručnik Olink Explore za upute o kontroli kvaliteta.

Planirajte sekvenciranje
Jedna Olink biblioteka može biti sekvencionirana po NextSeq™ 550 High Output protočnoj ćeliji i po ciklusu. Broj protočnih ćelija visokog izlaza i ciklusa potrebnih za sekvenciranje različitih kompleta reagensa Olink Explore opisan je u Tabeli 1. Ako je potrebno više od jednog ciklusa, ponovite uputstva opisana u ovom priručniku.

Tabela 1. Planiranje sekvenciranja:

Olink® Explore komplet reagensa	Broj Olink biblioteka	Broj protočnih ćelija i ciklusa
Komplet reagensa Olink® Explore 384	1	1
Olink® Explore 4 x 384 komplet reagensa	4	4
Komplet reagensa Olink® Explore 1536	4	4
Olink® Explore komplet reagensa za proširenje	4	4
Komplet reagensa Olink® Explore 3072	8	8

Instalirajte Olink® prilagođeni recept
Tokom ovog koraka, Olink® prilagođeni recept je instaliran na NextSeq™ 550. Ovaj korak treba da se izvede samo jednom, pre nego što se Olink sekvenciranje izvrši po prvi put.
NAPOMENA: Olink prilagođeni recept će raditi samo sa NextSeq™ 500/550 High Output Kits i NextSeq™ Control Software 4.0

1. Raspakujte i stavite Olink prilagođeni recept Olink_NSQ550_HighOutput_V1 u sljedeću mapu NextSeq™ 550 instrumenta: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
2. U okviru Prilagođavanje sistema > Upravljanje instrumentom, omogućite prilagođene recepte. Ako nije odabrana, opcija prilagođenog recepta se neće pojaviti tokom podešavanja pokretanja.

NAPOMENA: U verziji softvera NCS 4.0, opcija odabira prilagođenog recepta pojavit će se tek nakon što se uložak za reagens ubaci, a ne na ranijoj stranici za podešavanje.
NAPOMENA: Rad mora biti postavljen u ručnom načinu rada kako bi se omogućili prilagođeni recepti.

Pripremite reagense za sekvenciranje

Tokom ovog koraka, uložak za reagens koji sadrži reagense za grupisanje i sekvenciranje se odmrzava i priprema se protočna ćelija.

Pripremite kertridž za reagens
UPOZORENJE: Kartridž za reagens sadrži potencijalno opasne hemikalije. Nosite adekvatnu zaštitnu opremu i bacite upotrijebljene reagense u skladu sa važećim standardima. Za više informacija pogledajte Sistemski vodič za Illumina NextSeq 550 (dokument #15069765).

Pripremite klupu

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2 (75 ciklusa).

Uputstva

1. Stavite zamrznuti uložak za reagens napola potopljen u sobnu temperaturu i ostavite da se odmrzne 1 sat. Uverite se da su svi rezervoari za reagens u kertridžima potpuno odmrznuti.
   NAPOMENA: Radi praktičnosti, odmrznite uložak dan ranije i čuvajte ga preko noći na 4 °C. Na ovoj temperaturi reagensi su stabilni do jedne sedmice.
2. Temeljito osušite bazu patrone papirnim ubrusom i po potrebi osušite zaptivke od folije maramicom koja ne ostavlja dlačice.
3. Okrenite uložak deset puta da se odmrznuti reagensi dobro promešaju.
4. Lagano kucnite kertridžom o klupu kako biste uklonili mjehuriće zraka. Čuvajte kertridž na sobnoj temperaturi ako će se koristiti u roku od 4 sata.

Pripremite protočnu ćeliju

Pripremite klupu

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5.

Uputstva

1.  Ohlađenu protočnu ćeliju staviti na sobnu temperaturu 30 minuta.
2.  Stavite nove rukavice bez pudera (kako biste izbjegli kontaminaciju staklene površine protočne ćelije).
3.  Kada ste spremni da umetnete protočnu ćeliju u instrument, uklonite protočnu ćeliju iz pakovanja i plastične preklopne školjke.
4.  Pregledajte protočnu ćeliju. Ako su čestice ili prašina vidljivi na bilo kojoj od staklenih površina, očistite odgovarajuću površinu maramicom izopropil alkohola koja ne ostavlja dlačice i osušite je laboratorijskom maramicom bez vlakana.

Pripremite Olink® biblioteku za sekvenciranje

Tokom ovog koraka pripremaju se razrjeđenja NaOH i Tris-HCl, a pročišćena i kontrolirana Olink biblioteka se razrjeđuje i denaturira u uzastopnim koracima.

Pripremite razrjeđenje NaOH
Razrjeđenje NaOH se koristi za denaturaciju biblioteka.

Pripremite klupu

• 1 N zaliha NaOH
• MilliQ voda
• 1x cijev za mikrocentrifugu (1.5 mL)
• Ručna pipeta (10-100 μL)
• Vrhovi za filter pipete

Prije nego počnete
Označite epruvetu za mikrocentrifugu „NaOH“.

Uputstva

1. Pripremite 0.2 N NaOH razrjeđenje u NaOH epruveti prema tabeli 2.
2. Temeljno protresite NaOH epruvetu i okrenite je prema dolje. Iskoristite u roku od 12 sati.

Tabela 2. Razblaživanje 0.2 N NaOH

Reagens	Zapremina (μL)
MilliQ voda	80
1 N zaliha NaOH	20

2.4.2 Pripremiti razrjeđenje Tris-HCl
Razrjeđenje Tris-HCl se koristi za neutralizaciju denaturirane biblioteke.

Pripremite klupu

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 temeljac (Trizma® hidroklorid otopina)
• MilliQ voda
• 1x cijev za mikrocentrifugu (1.5 mL)
• Ručna pipeta (10-100 μL)
• Vrhovi za filter pipete

Prije nego počnete

• Označite epruvetu za mikrocentrifugu “Tris-HCl”

Uputstva

1. Pripremite 200 mM Tris-HCl razrjeđenje u Tris-HCl epruveti prema tabeli 3.
2. Temeljno protresite Tris-HCl epruvetu i okrenite je prema dolje.

Tabela 3. 200 mM Tris-HCl razrjeđenje:

Reagens	Zapremina (μL)
MilliQ voda	80
1M Tris-HCl pH 7.0 temeljac (Trizma® hidroklorid otopina)	20

Razblažite Olink® biblioteke
Tokom ovog koraka, pročišćena i kvalitetno kontrolisana Olink biblioteka se razblaži 1:33.

Pripremite klupu

• Lib Tube, pripremljena u skladu sa važećim korisničkim priručnikom Olink Explore
• MilliQ voda
• 1x cijev za mikrocentrifugu (1.5 mL)
• Ručne pipete (0.5-10 i 100-1000 μL)
• Vrhovi za filter pipete

Prije nego počnete

• Odmrznite Lib Tube ako je zamrznuta.
• Označite novu epruvetu za mikrocentrifugu: “Dil”.

Uputstva

1. Dodajte 96 μL MilliQ vode u Dil epruvetu.
2. Vortex the Lib Tube i nakratko je zavrtite.
3. Prenesite 3 μL iz Lib Tube u Dil Tube.
4. Zavrtite Dil Tube i nakratko je zavrtite

Denaturirajte i razrijedite Olink® Library do konačne koncentracije punjenja
Tokom ovog koraka, razrijeđena Olink biblioteka se denaturira i dalje razrjeđuje do konačne koncentracije punjenja.

Pripremite klupu

• Dil Tube, pripremljeno u prethodnom koraku
• 0.2 N NaOH razrjeđenje, svježe pripremljeno u prethodnom koraku
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) razrjeđenje, pripremljeno u prethodnom koraku
• Hibridizacijski bafer 1 (HT1) uključen u NextSeq™ Accessory Box v2
• 2x epruvete za mikrocentrifugu (1.5 mL i 2 mL)
• Ručne pipete (0.5-10 i 100-1000 μL)
• Vrhovi za filter pipete

Prije nego počnete

• Odmrznite zamrznuti HT1 pufer na sobnoj temperaturi. Čuvati na +4 °C do upotrebe.
• Označite novu epruvetu za mikrocentrifugu od 1.5 mL: “Den” (za denaturiranu biblioteku).
• Označite novu epruvetu za mikrocentrifugu od 2 mL: “Seq” (za biblioteku koja je spremna za punjenje).

Uputstva

1. Prenesite 5 μL iz Dil Tube u Den Tube.
2. Dodajte 5 μL 0.2 N NaOH u Den epruvetu.
3. Vrtite cijev Den i nakratko je zavrtite.
4. Inkubirajte Den Tube 5 minuta na sobnoj temperaturi da denaturirate biblioteku.
5. Dodajte 5 μL 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) u Den epruvetu da neutrališete reakciju.
6. Vrtite cijev Den i nakratko je zavrtite.
7. Dodajte 985 μL prethodno ohlađenog HT1 u Den epruvetu.
8. Vrtite cijev Den i nakratko je zavrtite. Tuba se može čuvati na +4 °C do upotrebe (isti dan).
9. Prenesite 205 μL iz Den Tube u Seq Tube.
10. Dodajte 1095 μL prethodno ohlađenog HT1 u Seq epruvetu.
11. Okrenite epruvetu Seq da pomiješate reagense i nakratko je zavrtite. Konačna zapremina punjenja je 1.3 mL.
12. Odmah nastavite na 2.5 Izvedite Olink® sekvenciranje.

Izvršite Olink® sekvenciranje

Tokom ovog koraka, puferski uložak, protočna ćelija i pripremljeni reagens kertridž koji sadrži Olink biblioteku se učitavaju u NextSeq 550, a sekvenciranje se pokreće korišćenjem Olink prilagođenog recepta.

Pripremite klupu

• Seq Tube (sa bibliotekom spremnom za učitavanje), pripremljena u prethodnom koraku
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, pripremljen u prethodnom koraku
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, pripremljen u prethodnom koraku
• 1x NextSeq™ 500/550 Buffer Cartridge v2 (75 ciklusa), na sobnoj temperaturi

Postavite parametre sekvenciranja
Tokom ovog koraka, parametri sekvenciranja se biraju na NextSeq™ 550.

1. Na početnom ekranu NextSeq™ 550 odaberite Eksperimentiraj.
2. Na ekranu Select Assay, izaberite Sequence.
3. Na stranici Podešavanje pokretanja odaberite Ručni način rada, a zatim Sljedeće.
4. Postavite parametre pokretanja na sljedeći način:
   • U polje Naziv pokretanja unesite jedinstveni ID eksperimenta.
   • U polje ID biblioteke unesite ID biblioteke koju koristite (opcionalno).
   • U polju Vrsta čitanja izaberite opciju Pojedinačno čitanje.
   • Unesite broj ciklusa na sljedeći način:
     • Čitaj 1:24
     • Indeks 1: 0
     • Indeks 2: 0
     • Čitaj 2:0
   • Ostavite potvrdni okvir za prilagođene prajmere neoznačenim.
   • Postavite lokaciju izlazne mape za trenutne neobrađene podatke. Odaberite Pregledaj da promijenite lokaciju izlazne mape.
5. Nemojte postavljati Sample Sheet.
6. Odaberite Purge potrošni materijal za ovo pokretanje.
7. Odaberite Sljedeće.

Učitajte protočnu ćeliju u NextSeq™ 550

1. Uklonite korištenu protočnu ćeliju iz prethodnog rada.
2. Stavite novu pripremljenu protočnu ćeliju na stage.
3. Odaberite Učitaj. Vrata se automatski zatvaraju.
4. Kada se ID protočne ćelije pojavi na ekranu i senzori su označeni zelenom bojom, izaberite Dalje

Ispraznite posudu za reagens
UPOZORENJE: Ovaj set reagensa sadrži potencijalno opasne hemikalije. Nosite adekvatnu zaštitnu opremu i bacite upotrijebljene reagense u skladu sa važećim standardima. Za više informacija pogledajte Sistemski vodič za Illumina NextSeq 550.

1. Otvorite vrata odjeljka za pufer, izvadite kontejner za istrošene reagense iz donjeg odjeljka i odložite sadržaj u skladu s važećim standardima.
2. Gurnite praznu posudu za reagens nazad u donji odeljak za pufer. Zvučni klik označava da je kontejner pravilno postavljen.

Učitajte tampon uložak

1. Uklonite korišteni pufer uložak iz gornjeg odjeljka za pufer i odložite sadržaj u skladu s važećim standardima.
2. Gurnite novi pufer uložak u gornji odeljak za tampon. Zvučni klik označava da je kertridž ispravno postavljen. Uvjerite se da se ID spremnika za međuspremnik pojavljuje na ekranu i da li su senzori označeni zelenom bojom.
3. Zatvorite vrata spremnika i odaberite Sljedeće.

Napunite kertridž za reagens

1. Otvorite vrata odjeljka za reagens, izvadite korišteni uložak za reagens i odložite neiskorišteni sadržaj u skladu sa važećim standardima. Rezervoar na poziciji 6 se može ukloniti kako bi se olakšalo sigurno odlaganje.
2. Probušite zaptivku rezervoara #10 sa oznakom „Ovde učitajte biblioteku“ čistim vrhom pipete od 1 mL.
3. Ubacite 1.3 mL Olink biblioteke iz Seq epruvete u rezervoar #10 označen kao “Load Library Here”.
4. Gurnite novi uložak za reagens u odjeljak za reagens i zatvorite vrata odjeljka za reagens.
5. Odaberite Učitaj i pričekajte ~30 sekundi dok se ID kertridža za reagens ne pojavi na ekranu i senzori ne budu označeni zelenom bojom.
6. Sa padajuće liste Recipe izaberite opciju recepta [Custom] “Olink_NSQ550_HighOutput_V1”.
7. Odaberite Sljedeće.

Započnite sekvenciranje

1. Potvrdite parametre rada prikazane na Review ekran. Da biste uredili bilo koje parametre, pritisnite Nazad za povratak na ekran Run Setup.
2. Odaberite Sljedeće. Rad počinje nakon automatske provjere prije pokretanja. Trajanje sekvenciranja je približno 7h30 min.
3. Očistite radno područje.

NAPOMENA: Kada se sekvencioniranje završi, softver pokreće automatsko pranje nakon pokretanja koristeći otopine za pranje koje se nalaze u pufer ulošku i NaOCl koji se nalazi u kertridžu za reagens. Ovo pranje traje otprilike 90 minuta. Dugme za početak postaje aktivno kada se pranje završi. Korištene patrone i protočna ćelija mogu se ostaviti na mjestu do sljedećeg rada.

Pratite napredak pokretanja
Olink koristi NGS kao očitavanje za kvantificiranje količine poznate sekvence kako bi se procijenila koncentracija datog proteina u samples (u odnosu na druge samples). Kvalitet podataka iz svakog ciklusa Explore sekvenciranja uglavnom je određen QC parametrima jedinstvenim za Olink tehnologiju. Stoga su standardne metrike kontrole kvaliteta koje se koriste u konvencionalnim NGS, kao što je Q-score, manje kritične.

Istorija revizija

Verzija	Datum	Opis
1.1	2021-12-13	Uredničke izmjene
1.0	2021-12-01	Novo

www.olink.com
Samo za istraživačku upotrebu. Nije za upotrebu u dijagnostičkim procedurama.
Ovaj proizvod uključuje licencu za nekomercijalnu upotrebu Olink proizvoda. Komercijalnim korisnicima mogu biti potrebne dodatne licence. Molimo kontaktirajte Olink
Proteomics AB za detalje. Ne postoje nikakve garancije, izričite ili implicirane, koje se protežu dalje od ovog opisa. Olink Proteomics AB nije odgovoran za imovinsku štetu, lične povrede ili ekonomski gubitak uzrokovan ovim proizvodom.
Sljedeći zaštitni znak je u vlasništvu Olink Proteomics AB: Olink®.
Ovaj proizvod je pokriven s nekoliko patenata i patentnih prijava dostupnih na https://www.olink.com/patents/.
© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Svi zaštitni znakovi trećih strana vlasništvo su njihovih vlasnika. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Švedska
1192, v1.1, 2021-12-13

Dokumenti / Resursi

Olink Explore Sequencing koristeći NextSeq 550 [pdf] Korisnički priručnik Istražite sekvenciranje koristeći NextSeq 550, istražite sekvenciranje koristeći NextSeq 550, NextSeq 550

Reference

• Uputstvo za upotrebu