Olink Fedezze fel a szekvenálást a NextSeq 550 segítségével

Bevezetés

Rendeltetésszerű használat
Az Olink® Explore egy multiplex immunológiai vizsgálati platform az emberi fehérje biomarkerek felfedezéséhez. A termék kizárólag kutatási célra készült, diagnosztikai eljárásokhoz nem. A laboratóriumi munkát csak képzett laboratóriumi személyzet végezheti. Az adatkezelést csak képzett személyzet végezheti. Az eredményeket a kutatók más klinikai vagy laboratóriumi leletekkel együtt kívánják felhasználni.

Erről a kézikönyvről
Ez a felhasználói kézikönyv tartalmazza az Olink® Explore Libraries sorrendbe állításához szükséges utasításokat az Illumina® NextSeq™ 550-en. Az utasításokat szigorúan és kifejezetten követni kell. Bármilyen eltérés a laboratóriumi lépések során, az adatok károsodásához vezethet. A laboratóriumi munkafolyamat megkezdése előtt forduljon az Olink® Explore Overhezview Felhasználói kézikönyv a platform bevezetéséhez, beleértve a reagensekre, a felszerelésre és a szükséges dokumentációra vonatkozó információkat isview a munkafolyamat, valamint a laboratóriumi irányelvek. Az Olink® Explore reagenskészletek használatára vonatkozó utasításokat a vonatkozó Olink® Explore felhasználói kézikönyvben találja. Az Olink® Explore sorozat eredményeinek adatfeldolgozásához és elemzéséhez lásd az Olink® MyData Cloud felhasználói kézikönyvet. Az ebben az anyagban található védjegyek és szerzői jogok az Olink® Proteomics AB tulajdonát képezik, hacsak nincs másképp jelezve.

Technikai támogatás
Technikai támogatásért forduljon az Olink Proteomicshoz a címen support@olink.com.

Laboratóriumi utasítások

Ez a fejezet útmutatást nyújt az Olink Libraries sorrendbe állításához a NextSeq™ 550-en a NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 ciklus) használatával. A szekvenáláshoz használt protokoll az Illumina® szabványos NGS munkafolyamat Illumina® NextSeq™ 550-hez adaptációja. A szekvenálás megkezdése előtt győződjön meg arról, hogy a tisztított könyvtár minőségét ellenőrizték. A minőségellenőrzéssel kapcsolatos utasításokért tekintse meg a vonatkozó Olink Explore felhasználói kézikönyvet.

Tervezze meg a sorozatfutást
Egy Olink Library szekvenálható NextSeq™ 550 High Output áramlási cellánként és futtatásonként. A különböző Olink Explore reagenskészletek sorrendbe állításához szükséges nagy teljesítményű áramlási cellák és futtatások számát az 1. táblázat írja le. Ha egynél több futtatásra van szükség, ismételje meg az ebben a kézikönyvben leírt utasításokat.

1. táblázat: Sorozatfutás tervezése:

Olink® Explore reagenskészlet	Olink-könyvtárak száma	Áramlási cella(k) és futás(ok) száma
Olink® Explore 384 reagenskészlet	1	1
Olink® Explore 4 x 384 reagenskészlet	4	4
Olink® Explore 1536 reagenskészlet	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 3072 reagenskészlet	8	8

Telepítse az Olink® egyedi receptjét
Ebben a lépésben az Olink® egyéni receptúra ​​telepítve van a NextSeq™ 550-re. Ezt a lépést csak egyszer kell végrehajtani, mielőtt először végrehajtaná az Olink szekvenálási futtatást.
JEGYZET: Az Olink egyedi receptje csak a NextSeq™ 500/550 High Output Kitekkel és a NextSeq™ Control Software 4.0-val működik.

1. Csomagolja ki és helyezze el az Olink egyéni receptjét (Olink_NSQ550_HighOutput_V1) a NextSeq™ 550 készülék következő mappájába: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recept\Custom\High\.
2. A Rendszer testreszabása > Eszköz kezelése alatt engedélyezze az Egyéni recepteket. Ha nincs kiválasztva, az egyéni recept opció nem jelenik meg a futtatás beállítása során.

JEGYZET: Az NCS 4.0 szoftververzióban az egyéni recept kiválasztásának lehetősége csak a reagenskazetta betöltése után jelenik meg, a korábbi beállítási oldalon nem.
JEGYZET: Az egyéni receptek engedélyezéséhez a futtatást kézi módba kell állítani.

Készítse elő a szekvenáló reagenseket

Ebben a lépésben a klaszterező és szekvenáló reagenseket tartalmazó reagens kazettát felengedik, és előkészítik az áramlási cellát.

Készítse elő a reagens kazettát
FIGYELMEZTETÉS: A reagens kazetta potenciálisan veszélyes vegyi anyagokat tartalmaz. Viseljen megfelelő védőfelszerelést, és dobja ki a használt reagenseket a vonatkozó szabványoknak megfelelően. További információkért tekintse meg az Illumina NextSeq 550 rendszer útmutatóját (dokumentum #15069765).

Készítse elő a padot

• 1x NextSeq™ 500/550 nagy teljesítményű reagenskazetta v2 (75 ciklus).

Utasítás

1. Helyezze a fagyasztott reagenspatront félig szobahőmérsékletű vízbe, és hagyja 1 órán át felengedni. Győződjön meg arról, hogy a patronok összes reagens tartálya teljesen felolvadt.
   JEGYZET: A kényelem kedvéért olvassa fel a patront előző nap, és tárolja egy éjszakán át 4 °C-on. Ezen a hőmérsékleten a reagensek egy hétig stabilak.
2. Alaposan szárítsa meg a patron alját papírtörlővel, és ha szükséges, szöszmentes kendővel törölje szárazra a fóliatömítéseket.
3. Tízszer fordítsa meg a patront, hogy a benne lévő felolvasztott reagensek alaposan összekeveredjenek.
4. Finoman ütögesse a patront a padon a légbuborékok eltávolításához. Tárolja a patront szobahőmérsékleten, ha 4 órán belül felhasználja.

Készítse elő az áramlási cellát

Készítse elő a padot

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5.

Utasítás

1.  Hozza fel a hűtött áramlási cellát szobahőmérsékletre 30 percre.
2.  Vegyen fel új púdermentes kesztyűt (hogy elkerülje az áramlási cella üvegfelületének szennyeződését).
3.  Amikor készen áll az áramlási cella betöltésére a műszerbe, vegye ki az áramlási cellát a csomagolásból és a műanyag kagylóhéjból.
4.  Vizsgálja meg az áramlási cellát. Ha az üvegfelületek bármelyikén részecskék vagy porok láthatók, tisztítsa meg az érintett felületet szöszmentes izopropil-alkoholos törlőkendővel, és szárítsa meg kevésbé szöszölő laboratóriumi kendővel.

Készítse elő az Olink® Library-t a szekvenáláshoz

Ebben a lépésben NaOH és Tris-HCl hígításokat készítenek, és a tisztított és minőségellenőrzött Olink Library-t egymást követő lépésekben hígítják és denaturálják.

Készítsünk NaOH-hígítást
A NaOH-hígítást a könyvtárak denaturálására használják.

Készítse elő a padot

• 1 N NaOH törzsoldat
• MilliQ víz
• 1x mikrocentrifuga cső (1.5 ml)
• Kézi pipetta (10-100 μL)
• Szűrő pipettahegyek

Mielőtt elkezdené
Jelölje meg a mikrocentrifuga csövet „NaOH”-val.

Utasítás

1. Készítsen 0.2 N NaOH-hígítást a NaOH-csőben a 2. táblázat szerint.
2. Vortexelje alaposan a NaOH csövet, és forgassa le. 12 órán belül használja fel.

2. táblázat. 0.2 N NaOH hígítás

Reagens	Térfogat (μL)
MilliQ víz	80
1 N NaOH törzsoldat	20

2.4.2 Trisz-HCl hígítás elkészítése
A Tris-HCl hígítást a denaturált könyvtár semlegesítésére használjuk.

Készítse elő a padot

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 törzsoldat (Trizma® hidroklorid oldat)
• MilliQ víz
• 1x mikrocentrifuga cső (1.5 ml)
• Kézi pipetta (10-100 μL)
• Szűrő pipettahegyek

Mielőtt elkezdené

• Jelölje meg a mikrocentrifuga csövet „Tris-HCl”

Utasítás

1. Készítsen 200 mM Tris-HCl hígítást a Tris-HCl csőben a 3. táblázat szerint.
2. Vortexelje alaposan a Tris-HCl csövet, és forgassa le.

3. táblázat. 200 mM Tris-HCl hígítás:

Reagens	Térfogat (μL)
MilliQ víz	80
1 M Tris-HCl pH 7.0 törzsoldat (Trizma® hidroklorid oldat)	20

Hígítsa fel az Olink® könyvtárakat
Ebben a lépésben a tisztított és minőségellenőrzött Olink Library-t 1:33 arányban hígítják.

Készítse elő a padot

• Lib Tube, a vonatkozó Olink Explore felhasználói kézikönyv szerint elkészítve
• MilliQ víz
• 1x mikrocentrifuga cső (1.5 ml)
• Kézi pipetták (0.5-10 és 100-1000 μl)
• Szűrő pipettahegyek

Mielőtt elkezdené

• Olvassa fel a Lib Tube-t, ha fagyott.
• Jelölje meg az új mikrocentrifuga csövet: „Dil”.

Utasítás

1. Adjon hozzá 96 μL MilliQ vizet a Dil csőhöz.
2. Vortexelje a Lib Tube-t, és röviden forgassa le.
3. Vigyen át 3 μL-t a Lib csőből a Dil csőbe.
4. Vortexelje a Dil csövet, és röviden forgassa le

Denaturálja és hígítsa fel az Olink® Library-t a végső töltési koncentrációig
Ebben a lépésben a hígított Olink Library denaturálódik, és tovább hígul a végső töltési koncentrációig.

Készítse elő a padot

• Dil Tube, az előző lépésben elkészítve
• 0.2 N NaOH hígítás, frissen készített az előző lépésben
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) hígítás, amelyet az előző lépésben készítettünk
• Az 1. hibridizációs puffer (HT1) a NextSeq™ tartozékdoboz v2-ben található
• 2x mikrocentrifuga cső (1.5 ml és 2 ml)
• Kézi pipetták (0.5-10 és 100-1000 μl)
• Szűrő pipettahegyek

Mielőtt elkezdené

• Olvassa fel a fagyasztott HT1 puffert szobahőmérsékleten. Felhasználásig +4 °C-on tárolandó.
• Jelölje meg az új 1.5 ml-es mikrocentrifuga csövet: „Den” (a denaturált könyvtárhoz).
• Jelölje meg az új 2 ml-es mikrocentrifuga csövet: „Seq” (a betöltésre kész könyvtárhoz).

Utasítás

1. Vigyen át 5 μL-t a Dil-csőből a Den Tube-be.
2. Adjon hozzá 5 μl 0.2 N NaOH-t a Den Tube-hoz.
3. Vortexelje a Den Tube-t, és röviden forgassa le.
4. Inkubálja a Den Tube-t 5 percig szobahőmérsékleten a könyvtár denaturálásához.
5. Adjon 5 μl 200 mM Tris-HCl-t (pH 7.0) a Den Tube-hoz, hogy semlegesítse a reakciót.
6. Vortexelje a Den Tube-t, és röviden forgassa le.
7. Adjon hozzá 985 μL előhűtött HT1-et a Den Tube-hoz.
8. Vortexelje a Den Tube-t, és röviden forgassa le. A tubus felhasználásig (aznap) +4 °C-on tárolható.
9. Töltsön át 205 μL-t a Den Tube-ból a Seq Tube-ba.
10. Adjon hozzá 1095 μL előhűtött HT1-et a Seq Tube-hoz.
11. Fordítsa meg a Seq Tube-t a reagensek összekeveréséhez, és röviden forgassa le. A végső betöltési térfogat 1.3 ml.
12. Azonnal folytassa a következővel: 2.5 Végezze el az Olink® szekvenálási futtatást.

Hajtsa végre az Olink® szekvenálási futtatást

Ebben a lépésben a pufferkazetta, az áramlási cella és az Olink Library-t tartalmazó előkészített reagens kazetta betöltődik a NextSeq 550-be, és elindul a szekvenálási futtatás az Olink egyedi receptje alapján.

Készítse elő a padot

• Seq Tube (betöltésre kész könyvtárral), amely az előző lépésben készült
• 1x NextSeq™ 500/550 nagy teljesítményű reagenskazetta v2, az előző lépésben elkészítve
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, előkészítve az előző lépésben
• 1x NextSeq™ 500/550 pufferkazetta v2 (75 ciklus), szobahőmérsékleten

Állítsa be a futási paraméterek sorrendjét
Ebben a lépésben a szekvenálási futási paraméterek kiválaszthatók a NextSeq™ 550-en.

1. A NextSeq™ 550 kezdőképernyőjén válassza a Kísérlet lehetőséget.
2. A Select Assay képernyőn válassza a Sequence lehetőséget.
3. A Futtatás beállítása oldalon válassza a Kézi futási módot, majd a Tovább lehetőséget.
4. Állítsa be a futási paramétereket az alábbiak szerint:
   • A Futtatás neve mezőben adjon meg egy egyedi kísérletazonosítót.
   • A Könyvtár azonosítója mezőbe írja be a futtatott könyvtár azonosítóját (nem kötelező).
   • Az Olvasás típusa mezőben válassza az Egyszeri olvasás lehetőséget.
   • Adja meg a ciklusok számát az alábbiak szerint:
     • Olvassa el az 1:24-et
     • 1. index: 0
     • 2. index: 0
     • Olvassa el az 2:0-et
   • Az egyéni primerek jelölőnégyzetét ne jelölje be.
   • Állítsa be a kimeneti mappa helyét az aktuális futtatott nyers adatokhoz. A kimeneti mappa helyének módosításához válassza a Tallózás lehetőséget.
5. Ne állítson be S-tample Lap.
6. Válassza a Fogyóeszközök tisztítása lehetőséget ehhez a futtatáshoz.
7. Válassza a Tovább lehetőséget.

Töltse be az áramlási cellát a NextSeq™ 550-be

1. Távolítsa el a használt áramlási cellát az előző futtatásból.
2. Helyezze az új előkészített áramlási cellát a stage.
3. Válassza a Betöltés lehetőséget. Az ajtó automatikusan becsukódik.
4. Amikor az áramlási cella azonosítója megjelenik a képernyőn, és az érzékelők zölddel vannak kijelölve, válassza a Tovább lehetőséget

Ürítse ki a reagenstartályt
FIGYELMEZTETÉS: Ez a reagenskészlet potenciálisan veszélyes vegyi anyagokat tartalmaz. Viseljen megfelelő védőfelszerelést, és dobja ki a használt reagenseket a vonatkozó szabványoknak megfelelően. További információkért tekintse meg az Illumina NextSeq 550 rendszer útmutatóját.

1. Nyissa ki a pufferrekesz ajtaját, vegye ki az elhasznált reagenstartályt az alsó rekeszből, és a vonatkozó szabványoknak megfelelően dobja ki a tartalmát.
2. Csúsztassa vissza az üres reagenstartályt az alsó pufferrekeszbe. Egy hallható kattanás jelzi, hogy a tartály megfelelően van elhelyezve.

Töltsön be pufferkazettát

1. Vegye ki a használt pufferkazettát a felső pufferrekeszből, és a vonatkozó szabványoknak megfelelően dobja ki a tartalmát.
2. Csúsztasson egy új pufferkazettát a felső pufferrekeszbe. Egy hallható kattanás jelzi, hogy a kazetta megfelelően van behelyezve. Győződjön meg arról, hogy a pufferkazetta azonosítója megjelenik a képernyőn, és az érzékelők zöld színnel vannak bejelölve.
3. Csukja be a pufferrekesz ajtaját, és válassza a Tovább gombot.

Töltse be a reagens kazettát

1. Nyissa ki a reagensrekesz ajtaját, vegye ki a használt reagenspatront, és a fel nem használt tartalmat a vonatkozó szabványoknak megfelelően dobja ki. A 6. pozícióban lévő tartály eltávolítható a biztonságos ártalmatlanítás érdekében.
2. Szúrja át a „Load Library Here” feliratú 10-es tartály tömítését egy tiszta 1 ml-es pipettahegy segítségével.
3. Töltsön 1.3 ml Olink Library-t a Seq Tube-ból a „Load Library Here” feliratú 10-es tartályba.
4. Csúsztassa be az új reagens kazettát a reagensrekeszbe, és csukja be a reagensrekesz ajtaját.
5. Válassza a Betöltés lehetőséget, és várjon kb. 30 másodpercet, amíg a reagens kazetta azonosítója megjelenik a képernyőn, és az érzékelők zöld színnel meg nem jelennek.
6. A Recept legördülő listából válassza ki az [Egyéni] „Olink_NSQ550_HighOutput_V1” receptopciót.
7. Válassza a Tovább lehetőséget.

Indítsa el a szekvenálás futtatását

1. Erősítse meg a Re-n megjelenő futási paramétereketview képernyő. A paraméterek módosításához nyomja meg a Vissza gombot, hogy visszatérjen a Run Setup képernyőre.
2. Válassza a Tovább lehetőséget. A futás egy automatikus futás előtti ellenőrzés után indul. A szekvenálás lefutási ideje körülbelül 7 óra 30 perc.
3. Tisztítsa meg a munkaterületet.

JEGYZET: Amikor a szekvenálási futtatás befejeződött, a szoftver elindít egy automatikus utómosást a pufferkazettában található mosóoldatok és a reagenskazettában található NaOCl felhasználásával. Ez a mosás körülbelül 90 percet vesz igénybe. A Kezdőlap gomb akkor válik aktívvá, ha a mosás befejeződött. A használt patronokat és az áramlási cellát a következő futtatásig a helyükön lehet hagyni.

Kövesse nyomon a futás előrehaladását
Olink az NGS-t használja leolvasóként egy ismert szekvencia mennyiségének számszerűsítésére, hogy megbecsülje egy adott fehérje koncentrációját másodpercbenamples (más samples). Az egyes Explore szekvenálási futtatások adatminőségét főként az Olink technológiára jellemző minőségellenőrzési paraméterek határozzák meg. Ezért a hagyományos NGS-ben használt szabványos minőség-ellenőrzési mérőszámok, mint például a Q-score, kevésbé kritikusak.

Revíziótörténet

Változat	Dátum	Leírás
1.1	2021-12-13	Szerkesztői változások
1.0	2021-12-01	Új

www.olink.com
Csak kutatási célra. Diagnosztikai eljárásokban nem használható.
Ez a termék licencet tartalmaz az Olink termékek nem kereskedelmi célú használatára. A kereskedelmi felhasználóknak további licencekre lehet szükségük. Kérjük, forduljon Olinkhoz
Proteomics AB a részletekért. Nincsenek kifejezett vagy hallgatólagos garanciák, amelyek túlmutatnak ezen a leíráson. Az Olink Proteomics AB nem vállal felelősséget a termék által okozott anyagi károkért, személyi sérülésekért vagy gazdasági veszteségekért.
A következő védjegy az Olink Proteomics AB tulajdona: Olink®.
Erre a termékre számos szabadalom és szabadalmi bejelentés vonatkozik, amelyek a következő címen érhetők el https://www.olink.com/patents/.
© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Minden harmadik fél védjegye a megfelelő tulajdonosok tulajdona. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Svédország
1192, v1.1, 2021-12-13

Dokumentumok / Források

Olink Fedezze fel a szekvenálást a NextSeq 550 segítségével [pdf] Felhasználói kézikönyv Fedezze fel a szekvenálást a NextSeq 550 segítségével, a szekvenálást a NextSeq 550 használatával, a NextSeq 550 segítségével

Hivatkozások

• Felhasználói kézikönyv