NextSeq 550을 사용한 Olink 탐색 시퀀싱
소개
용도
Olink® Explore는 인간 단백질 바이오마커 발견을 위한 다중 면역분석 플랫폼입니다. 이 제품은 연구 전용이며 진단 절차에 사용할 수 없습니다. 실험실 작업은 교육을 받은 실험실 직원만 수행해야 합니다. 데이터 처리는 교육을 받은 직원만 수행해야 합니다. 결과는 연구자가 다른 임상 또는 실험실 결과와 함께 사용하기 위한 것입니다.
이 매뉴얼에 대하여
이 사용자 매뉴얼은 Illumina® NextSeq™ 550에서 Olink® 탐색 라이브러리를 시퀀싱하는 데 필요한 지침을 제공합니다. 지침을 엄격하고 명시적으로 따라야 합니다. 실험실 단계 전체에서 편차가 있으면 데이터가 손상될 수 있습니다. 실험실 워크플로우를 시작하기 전에 Olink® Explore Over를 참조하십시오.view 시약, 장비 및 필요한 문서에 대한 정보를 포함하여 플랫폼 소개를 위한 사용자 설명서, 이상view 작업 흐름뿐만 아니라 실험실 지침. Olink® 탐색 시약 키트를 실행하는 방법에 대한 지침은 해당 Olink® 탐색 사용자 설명서를 참조하십시오. Olink® 탐색 시퀀스 결과의 데이터 처리 및 분석에 대해서는 Olink® MyData Cloud 사용자 가이드를 참조하십시오. 달리 명시되지 않는 한 이 자료에 포함된 모든 상표 및 저작권은 Olink® Proteomics AB의 재산입니다.
기술 지원
기술 지원은 Olink Proteomics에 문의하십시오. support@olink.com.
실험실 지침
이 장에서는 NextSeq™ 550/500 고출력 키트 v550(2.5주기)를 사용하여 NextSeq™ 75에서 Olink 라이브러리를 시퀀싱하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 시퀀싱에 사용되는 프로토콜은 Illumina® NextSeq™ 550용 Illumina® 표준 NGS 워크플로를 채택한 것입니다. 시퀀싱을 진행하기 전에 정제된 라이브러리의 품질이 검증되었는지 확인하십시오. 품질 관리에 대한 지침은 해당 Olink Explore 사용 설명서를 참조하십시오.
시퀀싱 실행 계획
NextSeq™ 550 고출력 플로우 셀 및 실행당 하나의 Olink 라이브러리를 시퀀싱할 수 있습니다. 다양한 Olink 탐색 시약 키트의 시퀀싱에 필요한 고출력 플로우 셀 및 실행의 수는 표 1에 설명되어 있습니다. 실행이 두 번 이상 필요한 경우 이 설명서에 설명된 지침을 반복하십시오.
표 1. 시퀀싱 실행 계획:
| Olink® 탐색 시약 키트 | Olink 라이브러리 수 | 플로우 셀 및 실행 수 |
| Olink® 탐색 384 시약 키트 | 1 | 1 |
| Olink® 탐색 4 x 384 시약 키트 | 4 | 4 |
| Olink® 탐색 1536 시약 키트 | 4 | 4 |
| Olink® 탐색 확장 시약 키트 | 4 | 4 |
| Olink® 탐색 3072 시약 키트 | 8 | 8 |
Olink® 사용자 지정 레시피 설치
이 단계에서 Olink® 맞춤형 레시피가 NextSeq™ 550에 설치됩니다. 이 단계는 Olink 시퀀싱 실행을 처음 수행하기 전에 한 번만 수행하면 됩니다.
메모: Olink 맞춤형 레시피는 NextSeq™ 500/550 고출력 키트 및 NextSeq™ 제어 소프트웨어 4.0에서만 작동합니다.
- NextSeq™ 550 기기의 다음 폴더에 Olink 사용자 지정 레시피 Olink_NSQ1_HighOutput_V550의 압축을 풀고 배치합니다. C:\Program Files\Illumina\NextSeq 제어 소프트웨어\Recipe\Custom\High\.
- 시스템 사용자 지정 > 기기 관리에서 사용자 지정 레시피를 활성화합니다. 선택하지 않으면 실행 설정 중에 맞춤 레시피 옵션이 나타나지 않습니다.
메모: NCS 4.0 소프트웨어 버전에서 맞춤 레시피를 선택하는 옵션은 이전 설정 페이지가 아니라 시약 카트리지를 로드한 후에만 나타납니다.
메모: 사용자 지정 레시피를 허용하려면 실행을 수동 모드로 설정해야 합니다.
시퀀싱 시약 준비
이 단계에서 클러스터링 및 시퀀싱 시약이 들어 있는 시약 카트리지를 해동하고 플로우 셀을 준비합니다.
시약 카트리지 준비
경고: 시약 카트리지에는 잠재적으로 위험한 화학 물질이 포함되어 있습니다. 적절한 보호 장비를 착용하고 해당 표준에 따라 사용한 시약을 폐기하십시오. 자세한 내용은 Illumina NextSeq 550 시스템 안내서(문서 번호 15069765)를 참조하십시오.
벤치 준비
- 1x NextSeq™ 500/550 고출력 시약 카트리지 v2(75주기).
지침
- 냉동 시약 카트리지를 실내 온도 조절 물에 반쯤 담근 후 1시간 동안 해동시킵니다. 카트리지의 모든 시약 저장소가 완전히 해동되었는지 확인하십시오.
메모: 편의를 위해 카트리지를 전날 해동하고 밤새 4°C에 보관하십시오. 이 온도에서 시약은 최대 XNUMX주일 동안 안정적입니다. - 종이 타월로 카트리지 베이스를 완전히 말리고 필요한 경우 보푸라기 없는 티슈로 호일 밀봉을 닦아 말립니다.
- 해동된 시약이 완전히 혼합되도록 카트리지를 XNUMX회 뒤집습니다.
- 벤치에서 카트리지를 부드럽게 두드려 기포를 제거합니다. 4시간 이내에 사용할 경우 카트리지를 실온에 보관하십시오.
플로우 셀 준비
벤치 준비
- 1x NextSeq™ 500/550 고출력 플로우 셀 v2.5.
지침
- 냉장된 플로우 셀을 실온에 30분 동안 둡니다.
- 새 가루 방지 장갑을 착용합니다(플로우 셀의 유리 표면 오염 방지).
- 플로우 셀을 기기에 장착할 준비가 되면 패키지와 플라스틱 클램쉘에서 플로우 셀을 꺼냅니다.
- 플로우 셀을 검사합니다. 유리 표면에 미립자나 먼지가 보이는 경우 보풀이 없는 이소프로필 알코올 천으로 해당 표면을 청소하고 보풀이 적은 실험실용 티슈로 건조시킵니다.
시퀀싱을 위한 Olink® 라이브러리 준비
이 단계에서 NaOH 및 Tris-HCl 희석액이 준비되고 정제되고 품질이 관리되는 Olink 라이브러리가 순차적 단계로 희석 및 변성됩니다.
NaOH 희석 준비
NaOH 희석액은 라이브러리를 변성시키는 데 사용됩니다.
벤치 준비
- 1N NaOH 스톡
- 밀리큐 워터
- 1x 마이크로 원심 분리기 튜브(1.5mL)
- 수동 피펫(10-100μL)
- 필터 피펫 팁
시작하기 전에
마이크로 원심 분리기 튜브 "NaOH"를 표시합니다.
지침
- 표 0.2에 따라 NaOH 튜브에 2N NaOH 희석액을 준비합니다.
- NaOH 튜브를 완전히 휘젓고 스핀다운합니다. 12시간 이내에 사용하십시오.
표 2. 0.2N NaOH 희석
| 시약 | 부피(μL) |
| 밀리큐 워터 | 80 |
| 1N NaOH 스톡 | 20 |
2.4.2 Tris-HCl 희석 준비
Tris-HCl 희석은 변성된 라이브러리를 중화하는 데 사용됩니다.
벤치 준비
- 1M Tris-HCl pH 7.0 스톡(Trizma® 하이드로클로라이드 용액)
- 밀리큐 워터
- 1x 마이크로 원심 분리기 튜브(1.5mL)
- 수동 피펫(10-100μL)
- 필터 피펫 팁
시작하기 전에
- 마이크로 원심 분리기 튜브 "Tris-HCl" 표시
지침
- 표 200에 따라 Tris-HCl 튜브에 3mM Tris-HCl 희석액을 준비합니다.
- Tris-HCl 튜브를 완전히 휘젓고 아래로 돌립니다.
표 3. 200mM Tris-HCl 희석:
| 시약 | 부피(μL) |
| 밀리큐 워터 | 80 |
| 1M Tris-HCl pH 7.0 스톡(Trizma® 하이드로클로라이드 용액) | 20 |
Olink® 라이브러리 희석
이 단계에서 정제되고 품질이 관리되는 Olink 라이브러리는 1:33으로 희석됩니다.
벤치 준비
- 해당 Olink Explore 사용 설명서에 따라 준비된 Lib Tube
- 밀리큐 워터
- 1x 마이크로 원심 분리기 튜브(1.5mL)
- 수동 피펫(0.5-10 및 100-1000 μL)
- 필터 피펫 팁
시작하기 전에
- 동결된 경우 Lib Tube를 해동하십시오.
- 새 미세 원심 분리기 튜브에 "Dil"을 표시합니다.
지침
- 96μL의 MilliQ 물을 Dil 튜브에 추가합니다.
- Lib Tube를 소용돌이치게 하고 아래로 짧게 회전시킵니다.
- Lib Tube에서 Dil Tube로 3μL를 옮깁니다.
- Dil Tube를 소용돌이치게 하고 짧게 회전시킵니다.
Olink® 라이브러리를 최종 로딩 농도로 변성 및 희석
이 단계에서 희석된 Olink 라이브러리는 변성되고 최종 로딩 농도로 추가 희석됩니다.
벤치 준비
- 이전 단계에서 준비한 딜 튜브
- 0.2N NaOH 희석, 이전 단계에서 새로 준비
- 200mM Tris-HCl(pH 7.0) 희석, 이전 단계에서 준비
- NextSeq™ Accessory Box v1에 포함된 HT1(Hybridization Buffer 2)
- 2x Microcentrifuge 튜브(1.5mL 및 2mL)
- 수동 피펫(0.5-10 및 100-1000 μL)
- 필터 피펫 팁
시작하기 전에
- 냉동된 HT1 버퍼를 실온에서 해동합니다. 사용할 때까지 +4 °C에서 보관하십시오.
- 새 1.5mL 마이크로원심분리기 튜브에 "Den"(변성 라이브러리용)을 표시합니다.
- 새 2mL 마이크로원심분리기 튜브에 "Seq"(라이브러리를 로드할 준비가 된 경우)를 표시합니다.
지침
- Dil Tube에서 Den Tube로 5 μL를 옮깁니다.
- Den Tube에 5 μL의 0.2 N NaOH를 추가합니다.
- Den Tube를 소용돌이치게 하고 잠시 아래로 돌립니다.
- Den Tube를 실온에서 5분 동안 배양하여 라이브러리를 변성시킵니다.
- Den Tube에 5 μL의 200 mM Tris-HCl(pH 7.0)을 추가하여 반응을 중화합니다.
- Den Tube를 소용돌이치게 하고 잠시 아래로 돌립니다.
- Den Tube에 985 μL의 미리 냉각된 HT1을 추가합니다.
- Den Tube를 소용돌이치게 하고 잠시 아래로 돌립니다. 튜브는 사용할 때까지 +4 °C에서 보관할 수 있습니다(당일).
- Den Tube에서 Seq Tube로 205μL를 옮깁니다.
- 1095 μL의 미리 냉각된 HT1을 Seq 튜브에 추가합니다.
- Seq Tube를 뒤집어 시약을 혼합하고 짧게 회전시킵니다. 최종 로딩 부피는 1.3mL입니다.
- 즉시 2.5 Olink® 시퀀싱 실행을 계속하십시오.
Olink® 시퀀싱 실행 수행
이 단계에서 버퍼 카트리지, 플로우 셀 및 Olink 라이브러리가 포함된 준비된 시약 카트리지가 NextSeq 550에 로드되고 Olink 사용자 지정 레시피를 사용하여 시퀀싱 실행이 시작됩니다.
벤치 준비
- 이전 단계에서 준비한 Seq 튜브(라이브러리 로드 준비 완료)
- 1x NextSeq™ 500/550 고출력 시약 카트리지 v2, 이전 단계에서 준비
- 이전 단계에서 준비한 1x NextSeq™ 500/550 고출력 플로우 셀 v2.5
- 1x NextSeq™ 500/550 버퍼 카트리지 v2(75주기), 실온
시퀀싱 실행 매개변수 설정
이 단계에서 시퀀싱 실행 매개변수는 NextSeq™ 550에서 선택됩니다.
- NextSeq™ 550 홈 화면에서 실험을 선택합니다.
- 분석 선택 화면에서 시퀀스를 선택합니다.
- 실행 설정 페이지에서 수동 실행 모드를 선택한 후 다음을 선택하십시오.
- 다음과 같이 실행 매개변수를 설정합니다.
- 실행 이름 필드에 고유한 실험 ID를 입력합니다.
- 라이브러리 ID 필드에 실행 중인 라이브러리의 ID를 입력합니다(선택 사항).
- 읽기 유형 필드에서 단일 읽기 옵션을 선택합니다.
- 다음과 같이 주기 수를 입력합니다.
- 읽기 1: 24
- 인덱스 1: 0
- 인덱스 2: 0
- 읽기 2: 0
- 사용자 지정 프라이머에 대한 확인란을 선택하지 않은 상태로 유지합니다.
- 현재 실행 원시 데이터의 출력 폴더 위치를 설정합니다. 찾아보기를 선택하여 출력 폴더 위치를 변경합니다.
- S를 설정하지 마십시오amp르 시트.
- 이 실행에 대한 소모품 제거를 선택합니다.
- 다음을 선택하세요.
NextSeq™ 550에 플로우 셀 로드
- 이전 실행에서 사용한 플로우 셀을 제거합니다.
- 새로 준비한 플로우 셀을 s에 놓습니다.tage.
- 로드를 선택합니다. 문이 자동으로 닫힙니다.
- 화면에 플로우 셀 ID가 나타나고 센서가 녹색으로 체크되면 다음을 선택합니다.
시약 용기 비우기
경고: 이 시약 세트에는 잠재적으로 위험한 화학 물질이 포함되어 있습니다. 적절한 보호 장비를 착용하고 해당 표준에 따라 사용한 시약을 폐기하십시오. 자세한 내용은 Illumina NextSeq 550 시스템 안내서를 참조하십시오.
- 완충제 부분의 도어를 열고 하단 부분에서 폐시약 용기를 꺼내어 해당 표준에 따라 내용물을 폐기하십시오.
- 빈 시약 용기를 하단 버퍼 구획으로 다시 밀어 넣습니다. 찰칵 소리가 나면 용기가 올바르게 놓였음을 나타냅니다.
버퍼 카트리지 로드
- 사용한 완충제 카트리지를 상단 완충제 구획에서 제거하고 해당 표준에 따라 내용물을 폐기하십시오.
- 새 완충제 카트리지를 상단 완충제 구획으로 밀어 넣습니다. 딸깍 소리가 나면 카트리지가 올바르게 배치되었음을 나타냅니다. 버퍼 카트리지 ID가 화면에 나타나고 센서가 녹색으로 표시되는지 확인하십시오.
- 버퍼 구획의 문을 닫고 다음을 선택합니다.
시약 카트리지 장착
- 시약 부분의 도어를 열고 사용한 시약 카트리지를 제거하고 사용하지 않은 내용물을 해당 표준에 따라 폐기하십시오. 위치 6의 저장소는 안전한 폐기를 위해 제거할 수 있습니다.
- 깨끗한 10mL 피펫 팁으로 "여기에 라이브러리 로드"라고 표시된 저장소 #1의 밀봉을 뚫습니다.
- Seq 튜브에서 Olink 라이브러리 1.3mL를 "여기에 라이브러리 로드"라고 표시된 저장소 #10에 로드합니다.
- 새 시약 카트리지를 시약 부분에 밀어 넣고 시약 부분 도어를 닫습니다.
- 로드를 선택하고 시약 카트리지 ID가 화면에 나타나고 센서가 녹색으로 표시될 때까지 ~30초 동안 기다립니다.
- 레시피 드롭다운 목록에서 [사용자 정의] “Olink_NSQ550_HighOutput_V1” 레시피 옵션을 선택합니다.
- 다음을 선택하세요.
시퀀싱 실행 시작
- Re에 표시된 실행 매개변수를 확인합니다.view 화면. 매개변수를 편집하려면 뒤로를 눌러 실행 설정 화면으로 돌아갑니다.
- 다음을 선택합니다. 자동 사전 실행 확인 후 실행이 시작됩니다. 시퀀싱 실행 시간은 약 7시간 30분입니다.
- 작업 공간을 청소하십시오.
메모: 시퀀싱 실행이 완료되면 소프트웨어는 버퍼 카트리지에 제공된 세척 용액과 시약 카트리지에 제공된 NaOCl을 사용하여 실행 후 자동 세척을 시작합니다. 이 세척은 약 90분이 소요됩니다. 세척이 완료되면 홈 버튼이 활성화됩니다. 사용한 카트리지와 플로우 셀은 다음 실행까지 제자리에 둘 수 있습니다.
실행 진행률 모니터링
Olink는 s에서 주어진 단백질의 농도를 추정하기 위해 알려진 서열의 양을 정량화하는 판독값으로 NGS를 사용합니다.amples (다른 s에 비해amp레). 각 탐색 시퀀싱 실행의 데이터 품질은 주로 Olink 기술 고유의 QC 매개변수에 의해 결정됩니다. 따라서 Q-점수와 같은 기존 NGS에 사용되는 표준 품질 관리 메트릭은 덜 중요합니다.
개정 내역
| 버전 | 날짜 | 설명 |
| 1.1 | 2021-12-13 | 편집 변경 사항 |
| 1.0 | 2021-12-01 | 새로운 |
www.olink.com
연구 전용. 진단 절차에 사용하지 마십시오.
이 제품에는 Olink 제품의 비상업적 사용에 대한 라이선스가 포함되어 있습니다. 상업용 사용자는 추가 라이선스가 필요할 수 있습니다. Olink에 문의하십시오
자세한 내용은 Proteomics AB를 참조하십시오. 이 설명을 넘어서는 명시적 또는 묵시적 보증은 없습니다. Olink Proteomics AB는 이 제품으로 인한 재산 피해, 개인 상해 또는 경제적 손실에 대해 책임을 지지 않습니다.
다음 상표는 Olink Proteomics AB 소유입니다: Olink®.
이 제품은 다음에서 사용할 수 있는 여러 특허 및 특허 출원에 의해 보호됩니다. https://www.olink.com/patents/.
© 저작권 2021 Olink Proteomics AB. 모든 타사 상표는 해당 소유자의 재산입니다. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Sweden
1192, v1.1, 2021-12-13
문서 / 리소스
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NextSeq 550을 사용한 Olink 탐색 시퀀싱 [PDF 파일] 사용자 매뉴얼 NextSeq 550을 사용한 탐색 시퀀싱, NextSeq 550을 사용한 탐색 시퀀싱, NextSeq 550 |
