Olink Explore Sequencing naudojant NextSeq 550

Įvadas

Naudojimas pagal paskirtį
Olink® Explore yra daugialypė imuninio tyrimo platforma, skirta žmogaus baltymų biomarkerių atradimui. Produktas skirtas naudoti tik moksliniams tyrimams, o ne diagnostikos procedūroms. Laboratorinius darbus gali atlikti tik apmokytas laboratorijos personalas. Duomenis tvarkyti gali tik apmokyti darbuotojai. Rezultatai skirti tyrėjams naudoti kartu su kitais klinikiniais ar laboratoriniais duomenimis.

Apie šį vadovą
Šiame naudotojo vadove pateikiamos instrukcijos, reikalingos „Olink® Explore Libraries“ tvarkyti „Illumina® NextSeq™ 550“. Instrukcijų turi būti griežtai ir aiškiai laikomasi. Bet kokie nukrypimai atliekant laboratorinius veiksmus gali pabloginti duomenis. Prieš pradėdami laboratorijos darbo eigą, pasitarkite su Olink® Explore Overview Naudotojo vadovas, skirtas supažindinti su platforma, įskaitant informaciją apie reagentus, įrangą ir reikalingą dokumentacijąview darbo eigos, taip pat laboratorinių nurodymų. Instrukcijų, kaip paleisti Olink® Explore reagentų rinkinius, rasite atitinkamame Olink® Explore vartotojo vadove. Duomenų apdorojimo ir Olink® Explore sekos rezultatų analizės ieškokite Olink® MyData Cloud vartotojo vadove. Visi šioje medžiagoje esantys prekių ženklai ir autorių teisės yra Olink® Proteomics AB nuosavybė, jei nenurodyta kitaip.

Techninė pagalba
Dėl techninės pagalbos susisiekite su Olink Proteomics adresu support@olink.com.

Laboratorinės instrukcijos

Šiame skyriuje pateikiamos instrukcijos, kaip sekti Olink bibliotekas NextSeq™ 550 naudojant NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 ciklai). Sekos nustatymui naudojamas protokolas yra Illumina® standartinės NGS darbo eigos, skirtos Illumina® NextSeq™ 550, pritaikymas. Prieš tęsdami sekos nustatymą įsitikinkite, kad išgrynintos bibliotekos kokybė buvo patikrinta. Kokybės kontrolės instrukcijas rasite atitinkamame Olink Explore vartotojo vadove.

Suplanuokite sekos eigą
Vienai „Olink“ bibliotekai galima sekti vieną „NextSeq™ 550 High Output“ srauto elementą ir vieną kartą. Didelio išėjimo srauto elementų ir paleidimų skaičius, reikalingas skirtingiems Olink Explore reagentų rinkiniams sekti, aprašytas 1 lentelėje. Jei reikia daugiau nei vieno paleidimo, pakartokite šiame vadove aprašytas instrukcijas.

1 lentelė. Sekos eigos planavimas:

Olink® Explore Reagent Kit	Olinko bibliotekų skaičius	Srauto (-ių) elementų ir paleidimo (-ių) skaičius
Olink® Explore 384 reagentų rinkinys	1	1
Olink® Explore 4 x 384 reagentų rinkinys	4	4
Olink® Explore 1536 reagentų rinkinys	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 3072 reagentų rinkinys	8	8

Įdiekite tinkintą Olink® receptą
Atliekant šį veiksmą, „NextSeq™ 550“ įdiegiamas „Olink®“ pritaikytas receptas. Šį veiksmą reikia atlikti tik vieną kartą, prieš pirmą kartą atliekant Olink sekos nustatymą.
PASTABA: Pasirinktinis Olink receptas veiks tik su NextSeq™ 500/550 didelės išvesties rinkiniais ir NextSeq™ valdymo programine įranga 4.0

1. Išpakuokite ir įdėkite tinkintą Olink receptą Olink_NSQ550_HighOutput_V1 į šį NextSeq™ 550 instrumento aplanką: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
2. Dalyje Sistemos pritaikymas > Tvarkyti priemonę įgalinkite pasirinktinius receptus. Jei nepasirinksite, pasirinktinio recepto parinktis nebus rodoma vykdant sąranką.

PASTABA: NCS 4.0 programinės įrangos versijoje parinktis pasirinkti pasirinktinį receptą bus galima tik įdėjus reagento kasetę, o ne ankstesniame sąrankos puslapyje.
PASTABA: Paleidimas turi būti nustatytas rankiniu režimu, kad būtų galima naudoti pasirinktinius receptus.

Paruoškite sekos nustatymo reagentus

Šio etapo metu atšildoma reagentų kasetė, kurioje yra grupavimo ir sekos sudarymo reagentai, ir paruošiama srauto ląstelė.

Paruoškite reagento kasetę
ĮSPĖJIMAS: Reagento kasetėje yra potencialiai pavojingų cheminių medžiagų. Dėvėkite tinkamą apsauginę įrangą ir išmeskite panaudotus reagentus pagal galiojančius standartus. Daugiau informacijos rasite Illumina NextSeq 550 sistemos vadove (dokumentas Nr. 15069765).

Paruoškite suolą

• 1x NextSeq™ 500/550 didelės galios reagento kasetė v2 (75 ciklai).

Instrukcijos

1. Užšaldytą reagento kasetę įdėkite pusiau panardintą į kambario temperatūros vandenį ir leiskite atitirpti 1 valandą. Įsitikinkite, kad visi kasečių reagentų rezervuarai yra visiškai atšildyti.
   PASTABA: Kad būtų patogiau, atšildykite kasetę dieną prieš ir laikykite per naktį 4 °C temperatūroje. Esant tokiai temperatūrai, reagentai išlieka stabilūs iki vienos savaitės.
2. Gerai išdžiovinkite kasetės pagrindą popieriniu rankšluosčiu ir, jei reikia, nusausinkite folijos sandariklius be pūkelių.
3. Apverskite kasetę dešimt kartų, kad gerai susimaišytų atšildyti reagentai.
4. Švelniai bakstelėkite kasetę į stendą, kad pašalintumėte oro burbuliukus. Laikykite užtaisą kambario temperatūroje, jei jis bus panaudotas per 4 valandas.

Paruoškite srauto ląstelę

Paruoškite suolą

• 1x NextSeq™ 500/550 didelio išėjimo srauto elementas, v2.5.

Instrukcijos

1.  Atšaldytą srauto elementą 30 minučių palaikykite iki kambario temperatūros.
2.  Užmaukite naujas pirštines be pudros (kad neužterštumėte srauto elemento stiklinio paviršiaus).
3.  Kai būsite pasiruošę įdėti srauto elementą į prietaisą, išimkite srauto elementą iš pakuotės ir plastikinį atverčiamąjį dangtelį.
4.  Patikrinkite srauto elementą. Jei ant kurio nors stiklo paviršiaus matomos dalelės ar dulkės, nuvalykite atitinkamą paviršių bepūkiška izopropilo alkoholio servetėle ir nusausinkite mažai pūkuojančia laboratorine servetėle.

Paruoškite Olink® biblioteką sekos nustatymui

Šio etapo metu paruošiami NaOH ir Tris-HCl skiedimai, o išgryninta ir kontroliuojama kokybė Olink biblioteka praskiedžiama ir denatūruojama nuosekliais etapais.

Paruoškite NaOH skiedimą
NaOH skiedimas naudojamas bibliotekoms denatūruoti.

Paruoškite suolą

• 1 N NaOH žaliava
• MilliQ vanduo
• 1x mikrocentrifugos mėgintuvėlis (1.5 ml)
• Rankinė pipetė (10-100 μL)
• Filtruoti pipetės antgaliai

Prieš pradėdami
Pažymėkite mikrocentrifugos mėgintuvėlį „NaOH“.

Instrukcijos

1. Paruoškite 0.2 N NaOH skiedinį NaOH mėgintuvėlyje pagal 2 lentelę.
2. Kruopščiai sumaišykite NaOH mėgintuvėlį ir sukite žemyn. Sunaudoti per 12 valandų.

2 lentelė. 0.2 N NaOH skiedimas

Reagentas	Tūris (μL)
MilliQ vanduo	80
1 N NaOH žaliava	20

2.4.2 Paruoškite Tris-HCl skiedimą
Denatūruotai bibliotekai neutralizuoti naudojamas Tris-HCl skiedimas.

Paruoškite suolą

• 1 M Tris-HCl pradinė pH 7.0 (Trizma® hidrochlorido tirpalas)
• MilliQ vanduo
• 1x mikrocentrifugos mėgintuvėlis (1.5 ml)
• Rankinė pipetė (10-100 μL)
• Filtruoti pipetės antgaliai

Prieš pradėdami

• Pažymėkite mikrocentrifugos mėgintuvėlį „Tris-HCl“

Instrukcijos

1. Paruoškite 200 mM Tris-HCl skiedinį Tris-HCl mėgintuvėlyje pagal 3 lentelę.
2. Kruopščiai sumaišykite Tris-HCl mėgintuvėlį ir sukite jį žemyn.

3 lentelė. 200 mM Tris-HCl skiedimas:

Reagentas	Tūris (μL)
MilliQ vanduo	80
1M Tris-HCl pradinė pH 7.0 (Trizma® hidrochlorido tirpalas)	20

Atskieskite Olink® bibliotekas
Šio etapo metu išgryninta ir kontroliuojama kokybė Olink biblioteka praskiedžiama santykiu 1:33.

Paruoškite suolą

• Lib Tube, paruoštas pagal taikomą Olink Explore vartotojo vadovą
• MilliQ vanduo
• 1x mikrocentrifugos mėgintuvėlis (1.5 ml)
• Rankinės pipetės (0.5–10 ir 100–1000 μL)
• Filtruoti pipetės antgaliai

Prieš pradėdami

• Atšildykite Lib Tube, jei jis užšaldytas.
• Pažymėkite naują mikrocentrifugos mėgintuvėlį: „Dil“.

Instrukcijos

1. Į Dil vamzdelį įpilkite 96 μL MilliQ vandens.
2. Sumaišykite Lib Tube ir trumpai pasukite žemyn.
3. Perkelkite 3 μL iš Lib vamzdelio į Dil vamzdelį.
4. Sumaišykite Dil Tube ir trumpai pasukite žemyn

Denatūruokite ir atskieskite Olink® Library iki galutinės įkrovos koncentracijos
Šio etapo metu praskiesta Olink biblioteka denatūruojama ir toliau skiedžiama iki galutinės įkrovos koncentracijos.

Paruoškite suolą

• Dil Tube, paruoštas ankstesniame žingsnyje
• 0.2 N NaOH skiedimas, ką tik paruoštas ankstesniame etape
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) skiedinys, paruoštas ankstesniame etape
• Hibridizacijos buferis 1 (HT1), įtrauktas į NextSeq™ priedų dėžutę v2
• 2x mikrocentrifugos mėgintuvėliai (1.5 ml ir 2 ml)
• Rankinės pipetės (0.5–10 ir 100–1000 μL)
• Filtruoti pipetės antgaliai

Prieš pradėdami

• Atšildykite užšaldytą HT1 buferį kambario temperatūroje. Iki naudojimo laikykite +4 °C temperatūroje.
• Pažymėkite naują 1.5 ml mikrocentrifugos mėgintuvėlį: „Den“ (denatūruotai bibliotekai).
• Pažymėkite naują 2 ml mikrocentrifugos mėgintuvėlį: „Seq“ (parengtai įkelti bibliotekai).

Instrukcijos

1. Perkelkite 5 μL iš Dil Tube į Den Tube.
2. Į Den Tube įpilkite 5 μL 0.2 N NaOH.
3. Susukite Den Tube ir trumpai pasukite žemyn.
4. Inkubuokite Den Tube 5 minutes kambario temperatūroje, kad denatūruotų biblioteką.
5. Reakcijai neutralizuoti įpilkite 5 μL 200 mM Tris-HCl (pH 7.0).
6. Susukite Den Tube ir trumpai pasukite žemyn.
7. Į Den Tube įpilkite 985 μL atšaldyto HT1.
8. Susukite Den Tube ir trumpai pasukite žemyn. Mėgintuvėlis gali būti laikomas +4 °C temperatūroje iki panaudojimo (tą pačią dieną).
9. Perkelkite 205 μL iš Den Tube į Seq Tube.
10. Į Seq mėgintuvėlį įpilkite 1095 μL iš anksto atšaldyto HT1.
11. Apverskite Seq Tube, kad sumaišytumėte reagentus, ir trumpai pasukite žemyn. Galutinis įkrovimo tūris yra 1.3 ml.
12. Nedelsdami tęskite 2.5 Atlikite Olink® sekos nustatymą.

Atlikite Olink® sekos nustatymą

Atliekant šį veiksmą, buferio kasetė, srauto elementas ir paruošta reagento kasetė, kurioje yra Olink biblioteka, įkeliami į NextSeq 550, o sekos nustatymas pradedamas naudojant pasirinktinį Olink receptą.

Paruoškite suolą

• Seq Tube (su paruošta įkelti biblioteka), paruošta ankstesniame žingsnyje
• 1x NextSeq™ 500/550 didelės galios reagento kasetė v2, paruošta ankstesniame žingsnyje
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, paruoštas ankstesniame veiksme
• 1x NextSeq™ 500/550 buferio kasetė v2 (75 ciklai), kambario temperatūroje

Nustatykite sekos vykdymo parametrus
Atliekant šį veiksmą, NextSeq™ 550 parenkami sekos vykdymo parametrai.

1. „NextSeq™ 550“ pagrindiniame ekrane pasirinkite Eksperimentas.
2. Ekrane Select Assay pasirinkite Sequence.
3. Puslapyje Vykdyti sąranką pasirinkite Rankinis paleidimo režimas, tada Kitas.
4. Nustatykite paleidimo parametrus taip:
   • Lauke Vykdymo pavadinimas įveskite unikalų eksperimento ID.
   • Lauke Bibliotekos ID įveskite naudojamos bibliotekos ID (nebūtina).
   • Lauke Skaitymo tipas pasirinkite parinktį Single Read.
   • Įveskite ciklų skaičių taip:
     • Skaityti 1:24
     • 1 indeksas: 0
     • 2 indeksas: 0
     • Skaityti 2:0
   • Nepažymėkite pasirinktinių pradmenų žymės langelio.
   • Nustatykite dabartinių neapdorotų duomenų išvesties aplanko vietą. Pasirinkite Naršyti, kad pakeistumėte išvesties aplanko vietą.
5. Nenustatykite Sample lapas.
6. Šiam paleidimui pasirinkite Išvalyti eksploatacines medžiagas.
7. Pasirinkite Kitas.

Įkelkite srauto elementą į NextSeq™ 550

1. Pašalinkite naudotą srauto elementą iš ankstesnio paleidimo.
2. Padėkite naują paruoštą srauto elementą ant stage.
3. Pasirinkite Įkelti. Durys užsidaro automatiškai.
4. Kai ekrane pasirodo srauto langelio ID ir jutikliai pažymėti žalia spalva, pasirinkite Kitas

Ištuštinkite reagento talpyklą
ĮSPĖJIMAS: Šiame reagentų rinkinyje yra potencialiai pavojingų cheminių medžiagų. Dėvėkite tinkamą apsauginę įrangą ir išmeskite panaudotus reagentus pagal galiojančius standartus. Daugiau informacijos rasite Illumina NextSeq 550 sistemos vadove.

1. Atidarykite buferio skyriaus dureles, iš apatinio skyriaus išimkite panaudotų reagentų talpyklą ir išmeskite turinį pagal galiojančius standartus.
2. Įstumkite tuščią reagento talpyklą atgal į apatinį buferio skyrių. Garsinis spragtelėjimas rodo, kad konteineris įdėtas teisingai.

Įdėkite buferio kasetę

1. Išimkite panaudotą buferio kasetę iš viršutinio buferio skyriaus ir išmeskite turinį pagal galiojančius standartus.
2. Įstumkite naują buferio kasetę į viršutinį buferio skyrių. Garsinis spragtelėjimas rodo, kad kasetė įdėta teisingai. Įsitikinkite, kad buferio kasetės ID rodomas ekrane ir jutikliai pažymėti žalia spalva.
3. Uždarykite buferio skyriaus dureles ir pasirinkite Kitas.

Įdėkite reagento kasetę

1. Atidarykite reagento skyriaus dureles, išimkite panaudotą reagento kasetę ir išmeskite nepanaudotą turinį pagal galiojančius standartus. 6 padėtyje esantis rezervuaras yra nuimamas, kad būtų lengviau jį išmesti.
2. 10 rezervuaro, pažymėto „Įkelkite biblioteką čia“, sandariklį pradurkite švariu 1 ml pipetės antgaliu.
3. Įdėkite 1.3 ml Olink bibliotekos iš Seq Tube į rezervuarą Nr. 10, pažymėtą kaip „Įkelti biblioteką čia“.
4. Įstumkite naują reagento kasetę į reagento skyrių ir uždarykite reagento skyriaus dureles.
5. Pasirinkite Load ir palaukite ~30 sekundžių, kol ekrane pasirodys reagento kasetės ID ir jutikliai bus pažymėti žalia spalva.
6. Išskleidžiamajame sąraše Receptas pasirinkite recepto parinktį [Custom] „Olink_NSQ550_HighOutput_V1“.
7. Pasirinkite Kitas.

Pradėkite sekos paleidimą

1. Patvirtinkite paleidimo parametrus, rodomus Review ekranas. Norėdami redaguoti bet kokius parametrus, paspauskite Atgal, kad grįžtumėte į Run Setup ekraną.
2. Pasirinkite Kitas. Paleidimas prasideda po automatinio patikrinimo prieš paleidimą. Sekos vykdymo laikas yra maždaug 7h30 min.
3. Išvalykite darbo vietą.

PASTABA: Pasibaigus sekos nustatymui, programinė įranga inicijuoja automatinį plovimą po paleidimo, naudodama plovimo tirpalus, esančius buferio kasetėje, ir NaOCl, pateiktą reagento kasetėje. Šis plovimas trunka apie 90 minučių. Pagrindinis mygtukas suaktyvinamas, kai baigiamas skalbimas. Naudotas kasetes ir srauto elementą galima palikti vietoje iki kito paleidimo.

Stebėkite vykdymo eigą
Olinkas naudoja NGS kaip rodmenį, norėdamas kiekybiškai įvertinti žinomos sekos kiekį, kad įvertintų tam tikro baltymo koncentraciją samples (palyginti su kitais samples). Duomenų kokybę iš kiekvienos „Explore“ sekos paleidimo daugiausia lemia „Olink“ technologijai unikalūs QC parametrai. Taigi standartinės kokybės kontrolės metrikos, naudojamos įprastose NGS, tokios kaip Q balas, yra mažiau svarbios.

Revizijų istorija

Versija	Data	Aprašymas
1.1	2021-12-13	Redakciniai pakeitimai
1.0	2021-12-01	Nauja

www.olink.com
Tik tyrimams. Nenaudoti diagnostikos procedūroms.
Šiame gaminyje yra licencija nekomerciniam Olink produktų naudojimui. Komerciniams vartotojams gali prireikti papildomų licencijų. Susisiekite su Olinku
„Proteomics AB“ daugiau. Nėra jokių išreikštų ar numanomų garantijų, kurios viršytų šį aprašymą. Olink Proteomics AB neatsako už turtinę žalą, kūno sužalojimą ar ekonominius nuostolius, kuriuos sukėlė šis gaminys.
Šis prekės ženklas priklauso Olink Proteomics AB: Olink®.
Šiam gaminiui taikomi keli patentai ir patentų paraiškos, kurias galima rasti adresu https://www.olink.com/patents/.
© Autorių teisės 2021 Olink Proteomics AB. Visi trečiųjų šalių prekių ženklai yra atitinkamų jų savininkų nuosavybė. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B, SE-752 37 Upsala, Švedija
1192, v1.1, 2021-12-13

Dokumentai / Ištekliai

Olink Explore Sequencing naudojant NextSeq 550 [pdf] Naudotojo vadovas Naršykite seką naudodami NextSeq 550, Naršykite seką naudodami NextSeq 550, NextSeq 550

Nuorodos

• Vartotojo vadovas