Olink 使用 NextSeq 550 探索测序

介绍

预期用途
Olink® Explore 是一个用于人类蛋白质生物标志物发现的多重免疫分析平台。 该产品仅供研究使用，不得用于诊断程序。 实验室工作只能由经过培训的实验室工作人员进行。 数据处理只能由经过培训的人员进行。 结果旨在供研究人员与其他临床或实验室发现结合使用。

关于本手册
本用户手册提供了在 Illumina® NextSeq™ 550 上对 Olink® Explore Libraries 进行测序所需的说明。必须严格明确地遵守这些说明。 整个实验室步骤的任何偏差都可能导致数据受损。 在开始实验室工作流程之前，请查阅 Olink® Explore Overview 平台介绍的用户手册，包括有关试剂、设备和所需文档的信息，以及view 的工作流程，以及实验室指南。 有关如何运行 Olink® Explore 试剂盒的说明，请参阅适用的 Olink® Explore 用户手册。 Olink® Explore 序列结果的数据处理和分析，请参考 Olink® MyData Cloud 用户指南。 除非另有说明，否则本材料中包含的所有商标和版权均为 Olink® Proteomics AB 的财产。

技术支援
如需技术支持，请联系 Olink Proteomics，网址为 support@olink.com.

实验室说明

本章提供有关如何使用 NextSeq™ 550/500 高输出套件 v550（2.5 个循环）在 NextSeq™ 75 上对 Olink 文库进行测序的说明。 用于测序的方案改编自 Illumina® NextSeq™ 550 的 Illumina® 标准 NGS 工作流程。在进行测序之前，确保已验证纯化文库的质量。 有关质量控制的说明，请参阅适用的 Olink Explore 用户手册。

计划测序运行
每个 NextSeq™ 550 高输出流动槽和每次运行都可以对一个 Olink 文库进行测序。 表 1 中描述了对不同 Olink Explore 试剂盒进行测序所需的高产量流动槽和运行的数量。如果需要多次运行，请重复本手册中描述的说明。

表 1. 测序运行计划：

Olink®探索试剂盒	Olink图书馆数量	流通池数量和运行次数
Olink® Explore 384 试剂盒	1	1
Olink® Explore 4 x 384 试剂盒	4	4
Olink® Explore 1536 试剂盒	4	4
Olink® Explore 扩增试剂盒	4	4
Olink® Explore 3072 试剂盒	8	8

安装 Olink® 自定义配方
在此步骤中，Olink® 自定义配方将安装在 NextSeq™ 550 上。此步骤只需执行一次，即在首次执行 Olink 测序运行之前。
笔记： Olink 定制配方仅适用于 NextSeq™ 500/550 高产量试剂盒和 NextSeq™ 控制软件 4.0

1. 解压缩并将 Olink 自定义配方 Olink_NSQ550_HighOutput_V1 放入 NextSeq™ 550 仪器的以下文件夹中：C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\。
2. 在系统自定义 > 管理仪器下，启用自定义配方。 如果未选中，自定义配方选项将不会在运行设置期间出现。

笔记： 在 NCS 4.0 软件版本中，选择自定义配方的选项只会在试剂盒加载后出现，而不会出现在之前的设置页面中。
笔记： 必须将运行设置为手动模式以允许自定义配方。

准备测序试剂

在此步骤中，包含聚类和测序试剂的试剂盒被解冻并准备好流通池。

准备试剂盒
警告： 试剂盒包含有潜在危险的化学品。 穿戴适当的防护设备并根据适用标准丢弃用过的试剂。 有关详细信息，请参阅 Illumina NextSeq 550 系统指南（文档 #15069765）。

准备工作台

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2（75 个循环）。

指示

1. 将冷冻的试剂盒半浸入室温水中，让它解冻 1 小时。 确保墨盒的所有试剂槽都完全解冻。
   笔记： 为方便起见，请在前一天解冻墨盒，并将其在 4°C 下储存过夜。 在此温度下，试剂可稳定长达一周。
2. 用纸巾彻底擦干墨盒底座，并在需要时用无绒纸巾吸干铝箔密封件。
3. 翻转试剂盒十次以彻底混合其中解冻的试剂。
4. 在工作台上轻轻敲击墨盒以去除气泡。 如果墨盒将在 4 小时内使用，请将其存放在室温下。

准备流通池

准备工作台

• 1x NextSeq™ 500/550 高输出流通池 v2.5。

指示

1.  将冷藏的流通池置于室温下 30 分钟。
2.  戴上新的无粉手套（以避免污染流通池的玻璃表面）。
3.  准备好将流通池装入仪器时，从包装和塑料翻盖中取出流通池。
4.  检查流通池。 如果在任何玻璃表面上可见颗粒或灰尘，请使用无绒异丙醇擦拭布清洁适用表面，然后用低绒实验室纸巾擦干。

为测序准备 Olink® 文库

在此步骤中，准备了 NaOH 和 Tris-HCl 稀释液，并按顺序对纯化和质量控制的 Olink 库进行稀释和变性。

准备 NaOH 稀释液
NaOH 稀释液用于使文库变性。

准备工作台

• 1 N NaOH 储备液
• MilliQ水
• 1x 微量离心管 (1.5 mL)
• 手动移液器 (10-100 μL)
• 过滤移液器吸头

开始之前
标记微量离心管“NaOH”。

指示

1. 根据表 0.2 在 NaOH 管中制备 2 N NaOH 稀释液。
2. 彻底涡旋 NaOH 管并向下旋转。 12 小时内使用。

表 2. 0.2 N NaOH 稀释

试剂	体积 (μL)
MilliQ水	80
1 N NaOH 储备液	20

2.4.2 准备 Tris-HCl 稀释液
Tris-HCl 稀释液用于中和变性文库。

准备工作台

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 储备液（Trizma® 盐酸盐溶液）
• MilliQ水
• 1x 微量离心管 (1.5 mL)
• 手动移液器 (10-100 μL)
• 过滤移液器吸头

开始之前

• 标记微量离心管“Tris-HCl”

指示

1. 根据表 200 在 Tris-HCl 管中制备 3 mM Tris-HCl 稀释液。
2. 彻底涡旋 Tris-HCl 管并向下旋转。

表 3. 200 mM Tris-HCl 稀释液：

试剂	体积 (μL)
MilliQ水	80
1M Tris-HCl pH 7.0 储备液（Trizma® 盐酸盐溶液）	20

稀释 Olink® 文库
在此步骤中，纯化和质量控制的 Olink 库按 1:33 稀释。

准备工作台

• Lib Tube，根据适用的 Olink Explore 用户手册准备
• MilliQ水
• 1x 微量离心管 (1.5 mL)
• 手动移液器（0.5-10 和 100-1000 μL）
• 过滤移液器吸头

开始之前

• 如果冷冻，解冻 Lib 管。
• 标记新的微量离心管：“Dil”。

指示

1. 向稀释管中加入 96 μL MilliQ 水。
2. 涡旋 Lib 管并短暂旋转。
3. 将 3 μL 从 Lib 管转移到 Dil 管。
4. 涡旋稀释管并短暂旋转

将 Olink® 文库变性并稀释至最终加载浓度
在此步骤中，稀释的 Olink 库变性并进一步稀释至最终加载浓度。

准备工作台

• 上一步准备的稀释管
• 0.2 N NaOH 稀释液，在上一步中新鲜配制
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) 稀释液，在上一步中制备
• NextSeq™ 附件盒 v1 中包含的杂交缓冲液 1 (HT2)
• 2x 微量离心管（1.5 mL 和 2 mL）
• 手动移液器（0.5-10 和 100-1000 μL）
• 过滤移液器吸头

开始之前

• 在室温下解冻冷冻的 HT1 缓冲液。 储存在 +4 °C 直至使用。
• 标记新的 1.5 mL 微量离心管：“Den”（用于变性文库）。
• 标记新的 2 mL 微量离心管：“Seq”（用于准备加载库）。

指示

1. 将 5 μL 从稀释管转移到 Den 管。
2. 将 5 μL 的 0.2 N NaOH 添加到 Den 管中。
3. 涡旋 Den Tube 并短暂旋转。
4. 在室温下将 Den Tube 孵育 5 分钟以使文库变性。
5. 将 5 μL 的 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) 添加到 Den 管中以中和反应。
6. 涡旋 Den Tube 并短暂旋转。
7. 将 985 μL 的预冷 HT1 添加到 Den 管中。
8. 涡旋 Den Tube 并短暂旋转。 该管可以储存在 +4°C 直到使用（同一天）。
9. 将 205 μL 从 Den Tube 转移到 Seq Tube。
10. 将 1095 μL 的预冷 HT1 添加到 Seq 管中。
11. 倒置 Seq 管以混合试剂并短暂旋转。 最终加载体积为 1.3 mL。
12. 立即继续执行 2.5 执行 Olink® 测序运行。

执行 Olink® 测序运行

在此步骤中，缓冲液盒、流动槽和准备好的包含 Olink 库的试剂盒被加载到 NextSeq 550 中，并使用 Olink 自定义配方开始测序运行。

准备工作台

• Seq Tube（准备加载库），在上一步中准备好
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2，在上一步中准备
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5，在上一步中准备
• 1x NextSeq™ 500/550 Buffer Cartridge v2（75 个循环），室温

设置测序运行参数
在此步骤中，在 NextSeq™ 550 上选择测序运行参数。

1. 在 NextSeq™ 550 主屏幕上，选择实验。
2. 在“选择检测”屏幕上，选择“序列”。
3. 在运行设置页面中，选择手动运行模式，然后选择下一步。
4. 设置运行参数如下：
   • 在运行名称字段中，输入唯一的实验 ID。
   • 在库 ID 字段中，输入您正在运行的库的 ID（可选）。
   • 在 Read Type 字段中，选择 Single Read 选项。
   • 输入循环次数如下：
     • 阅读 1: 24
     • 索引 1：0
     • 索引 2：0
     • 阅读 2: 0
   • 保持未选中自定义引物的复选框。
   • 设置当前运行原始数据的输出文件夹位置。 选择浏览以更改输出文件夹位置。
5. 不要设置Samp乐表。
6. 为此运行选择清除耗材。
7. 选择下一步。

将流动槽装入 NextSeq™ 550

1. 从上次运行中取出使用过的流动槽。
2. 将新准备好的流动槽放在 s 上tage.
3. 选择加载。 门自动关闭。
4. 当流动槽 ID 出现在屏幕上并且传感器以绿色选中时，选择下一步

清空试剂容器
警告： 这套试剂含有潜在的危险化学品。 穿戴适当的防护设备并根据适用标准丢弃用过的试剂。 有关详细信息，请参阅 Illumina NextSeq 550 系统指南。

1. 打开缓冲液室的门，从下部室中取出用过的试剂容器，并按照适用标准处理内容物。
2. 将空试剂容器滑回下缓冲液室。 听到咔嗒声表示容器已正确放置。

加载缓冲盒

1. 从上缓冲液室中取出用过的缓冲液盒，并根据适用标准处理内容物。
2. 将新的缓冲液盒滑入上部缓冲液隔间。 听到咔嗒声表示墨盒已正确放置。 确保缓冲液盒 ID 出现在屏幕上并且传感器被选中为绿色。
3. 关闭缓冲室的门并选择下一步。

装入试剂盒

1. 打开试剂仓门，取出使用过的试剂盒，按照适用标准处理未使用的内容物。 位置 6 的储液罐可拆卸，以便于安全处置。
2. 用干净的 10 mL 移液器尖端刺穿标记为“在此处加载库”的水库 #1 的密封。
3. 将 1.3 mL 的 Olink 库从 Seq 管加载到标记为“在此处加载库”的水库 #10 中。
4. 将新试剂盒滑入试剂室并关闭试剂室门。
5. 选择加载并等待约 30 秒，直到试剂盒 ID 出现在屏幕上并且传感器被选中为绿色。
6. 从配方下拉列表中，选择[自定义]“Olink_NSQ550_HighOutput_V1”配方选项。
7. 选择下一步。

开始测序运行

1. 确认 Re 上显示的运行参数view 屏幕。 要编辑任何参数，请按返回返回到运行设置屏幕。
2. 选择下一步。 运行在自动运行前检查后开始。 测序运行时间约为 7 小时 30 分钟。
3. 清洁工作区域。

笔记： 测序运行完成后，软件会使用缓冲液盒中提供的清洗液和试剂盒中提供的 NaOCl 启动自动运行后清洗。 此清洗大约需要 90 分钟。 清洗完成后，“主页”按钮将激活。 用过的墨盒和流通池可以留在原处，直到下一次运行。

监控运行进度
Olink 使用 NGS 作为读数来量化已知序列的数量，以估计 s 中给定蛋白质的浓度amples（相对于其他 samp莱斯）。 每次 Explore 测序运行的数据质量主要取决于 Olink 技术独有的 QC 参数。 因此，传统 NGS 中使用的标准质量控制指标（例如 Q 分数）并不那么重要。

修订历史

版本	日期	描述
1.1	2021-12-13	编辑更改
1.0	2021-12-01	新的

奥凌网
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1192, v1.1, 2021-12-13

文件/资源

Olink 使用 NextSeq 550 探索测序 [pdf] 用户手册 使用 NextSeq 550 探索测序，使用 NextSeq 550 探索测序，NextSeq 550

参考

• 用户手册