Olink Esploru Sekvencadon uzante NextSeq 550

Enkonduko

Intencita uzo
Olink® Explore estas plurksa imunanaza platformo por malkovro de homa proteina biosigno. La produkto estas destinita Nur por Esplora Uzo, kaj ne por uzo en diagnozaj proceduroj. La laboratoria laboro devas esti prizorgita nur de edukita laboratoriopersonaro. Datumtraktado devas esti farita nur de edukita dungitaro. La rezultoj estas intencitaj esti uzataj de esploristoj kune kun aliaj klinikaj aŭ laboratoriaj trovoj.

Pri ĉi tiu manlibro
Ĉi tiu UzantManlibro provizas la instrukciojn necesajn por sekvenco Olink® Esplori Bibliotekojn sur Illumina® NextSeq™ 550. La instrukcioj devas esti strikte kaj eksplicite sekvitaj. Ajnaj devioj tra la laboratoriaj paŝoj povas rezultigi difektitajn datumojn. Antaŭ komenci la laborfluon de laboratorio, konsultu la Olink® Explore Overview Uzanta Manlibro por enkonduko al la platformo, inkluzive de informoj pri reakciiloj, ekipaĵo kaj dokumentado bezonata, kaj superview de la laborfluo, same kiel laboratoriogvidlinioj. Por instrukcioj pri kiel ruli la Olink® Explore Reagent Kits, raportu al la aplikebla Olink® Explore Uzan Manlibro. Por datumtraktado kaj analizo de la Olink® Explore-sekvencrezultoj, raportu al la Olink® MyData Cloud User Guide. Ĉiuj varmarkoj kaj kopirajtoj enhavitaj en ĉi tiu materialo estas la posedaĵo de Olink® Proteomics AB, krom se alie dirite.

Teknika subteno
Por teknika subteno, kontaktu Olink Proteomics ĉe support@olink.com.

Laboratoriaj instrukcioj

Ĉi tiu ĉapitro provizas instrukciojn pri kiel sekvenco Olink Bibliotekoj sur NextSeq™ 550 uzante la NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cikloj). La protokolo uzata por sekvencado estas adapto de la fluo de laboro Illumina® norma NGS por Illumina® NextSeq™ 550. Antaŭ ol daŭrigi sinsekvencado, certigu, ke la kvalito de la purigita Biblioteko estis kontrolita. Konsultu la uzantan manlibron de Olink Explore por instrukcioj pri kvalito-kontrolo.

Planu la sinsekvan kuron
Unu Olink Biblioteko povas esti sekvencita per NextSeq™ 550 High Output fluĉelo kaj per kuro. La nombro da High Output-fluaj ĉeloj kaj kuroj bezonataj por sekvenci la malsamajn Olink Explore Reagent Kits estas priskribita en Tabelo 1. Se pli ol unu kuroj necesas, ripetu la instrukciojn priskribitajn en ĉi tiu manlibro.

Tabelo 1. Sekvenca kurplanado:

Olink® Explore Reagent Kit	Nombro de Olink Bibliotekoj	Nombro de fluĉelo(j) kaj kuroj
Olink® Esploru 384-Reakciilo-Kion	1	1
Olink® Esploru 4 x 384 Reakciilo-Kion	4	4
Olink® Esploru 1536-Reakciilo-Kion	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Esploru 3072-Reakciilo-Kion	8	8

Instalu Olink® kutiman recepton
Dum ĉi tiu paŝo, la kutima recepto de Olink® estas instalita sur la NextSeq™ 550. Ĉi tiu paŝo nur devas esti farita unufoje, antaŭ ol Olink-sekvenca kuro estas farita por la unua fojo.
NOTO: La kutima recepto de Olink funkcios nur kun la NextSeq™ 500/550-Altaj Eligaĵoj kaj la NextSeq™ Kontrola Programaro 4.0

1. Malfermu kaj metu la kutiman recepton de Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 en la sekvan dosierujon de la instrumento NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Kontrola Programaro\Recepto\Persona\Alta\.
2. Sub Sistema Personigo > Administri Instrumenton, ebligu Proprajn Receptojn. Se ne estas elektita, la kutima recepta opcio ne aperos dum la rulagordo.

NOTO: En la NCS 4.0 programara versio, la opcio elekti kutiman recepton okazos nur post kiam la reakciaĵkartoĉo estas ŝarĝita, ne en la pli frua agorda paĝo.
NOTO: La kuro devas esti agordita en mana reĝimo por permesi kutimajn receptojn.

Preparu sekvencaj reakciiloj

Dum ĉi tiu paŝo, la reakciaĵkartoĉo enhavanta amasiĝadon kaj sekvencaj reakciiloj estas degelita kaj la fluĉelo estas preta.

Preparu reakcian kartoĉon
AVERTO: La reakciaĵkartoĉo enhavas eble danĝerajn kemiaĵojn. Portu taŭgan protektan ekipaĵon kaj forĵetu uzitajn reakcilojn laŭ aplikeblaj normoj. Por pliaj informoj, raportu al la Sistema Gvidilo Illumina NextSeq 550 (dokumento #15069765).

Preparu benkon

• 1x NextSeq™ 500/550 Altprodukta Reakciga Kartoĉo v2 (75 cikloj).

Instrukcioj

1. Metu la frostitan reakcian kartoĉon duone subakvitan en ĉambran harditan akvon kaj lasu ĝin degeli dum 1 horo. Certigu, ke ĉiuj reakciaĵrezervujoj de la kartoĉoj estas tute degelitaj.
   NOTO: Por komforto, degelu la kartoĉon la antaŭan tagon kaj konservu ĝin dum la nokto je 4 °C. Je ĉi tiu temperaturo, reakciiloj estas stabilaj ĝis unu semajno.
2. Sekigu la kartoĉan bazon ĝisfunde per papera tuko kaj sekigu la tavolfokojn sekigitajn per senŝeluza ŝtofo se necese.
3. Inversu la kartoĉon dek fojojn por ĝisfunde miksi la degelitajn reactivojn ene.
4. Frapu la kartoĉon milde sur la benko por forigi aervezikojn. Konservu la kartoĉon ĉe ĉambra temperaturo se ĝi estos uzata ene de 4 horoj.

Preparu fluĉelon

Preparu benkon

• 1x NextSeq™ 500/550 Alta Eliga Flua Ĉelo v2.5.

Instrukcioj

1.  Alportu la fridigitan fluoĉelon al ĉambra temperaturo dum 30 minutoj.
2.  Surmetu novajn pulvorajn gantojn (por eviti polui la vitran surfacon de la fluĉelo).
3.  Kiam vi pretas ŝargi la fluĉelon en la instrumenton, forigu la fluĉelon el la pakaĵo kaj la plastan konkon.
4.  Inspektu la fluoĉelon. Se partikloj aŭ polvo estas videblaj sur iu el la vitraj surfacoj, purigu la uzeblan surfacon per senŝnula izopropila alkohola viŝviŝaĵo kaj sekigu ĝin per malalta labo-labora histo.

Preparu Olink® Library por sekvencado

Dum ĉi tiu paŝo, NaOH kaj Tris-HCl-diluoj estas preparitaj, kaj la purigita kaj kvalite kontrolita Olink Library estas diluita kaj denaturita en sinsekvaj paŝoj.

Preparu NaOH-diluon
La NaOH-diluo estas uzata por denaturigi la Bibliotekojn.

Preparu benkon

• 1 N NaOH-akcio
• MilliQ-akvo
• 1x Mikrocentrifuga tubo (1.5 ml)
• Manlibropipeto (10-100 μL)
• Filtrila pipetkonsiletoj

Antaŭ ol vi komencu
Marku la mikrocentrifugan tubon "NaOH".

Instrukcioj

1. Preparu 0.2 N NaOH-diluon en la NaOH-Tubo laŭ Tabelo 2.
2. Vortu la NaOH-Tubon ĝisfunde kaj ŝpinu malsupren. Uzu ene de 12 horoj.

Tabelo 2. 0.2 N NaOH diluo

Reakciilo	Volumo (μL)
MilliQ-akvo	80
1 N NaOH-akcio	20

2.4.2 Preparu Tris-HCl-diluon
La Tris-HCl-diluo estas uzata por neŭtraligi la denaturigitan Bibliotekon.

Preparu benkon

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 stoko (Trizma® klorhidrata solvo)
• MilliQ-akvo
• 1x Mikrocentrifuga tubo (1.5 ml)
• Manlibropipeto (10-100 μL)
• Filtrila pipetkonsiletoj

Antaŭ ol vi komencu

• Marku la mikrocentrifugan tubon "Tris-HCl"

Instrukcioj

1. Preparu 200 mM Tris-HCl-diluon en la Tris-HCl Tubo laŭ Tabelo 3.
2. Vortexu la Tubon Tris-HCl ĝisfunde kaj ŝpinu ĝin malsupren.

Tablo 3. 200 mM Tris-HCl-diluo:

Reakciilo	Volumo (μL)
MilliQ-akvo	80
1M Tris-HCl pH 7.0 stoko (Trizma® klorhidrata solvo)	20

Diluu Olink® Bibliotekojn
Dum ĉi tiu paŝo, la purigita kaj kvalite kontrolita Olink Biblioteko estas diluita 1:33.

Preparu benkon

• Lib Tube, preparita laŭ la aplikebla Olink Explore UzantManlibro
• MilliQ-akvo
• 1x Mikrocentrifuga tubo (1.5 ml)
• Manaj pipetoj (0.5-10 kaj 100-1000 μL)
• Filtrila pipetkonsiletoj

Antaŭ ol vi komencu

• Degelu la Lib Tubon se frostigite.
• Marku la novan mikrocentrifugan tubon: "Dil".

Instrukcioj

1. Aldonu 96 μL da MilliQ-akvo al la Dil-Tubo.
2. Vortigu la Lib Tubon kaj ŝpinu ĝin mallonge.
3. Transloku 3 μL de la Lib-Tubo al la Dil-Tubo.
4. Vortex la Dil Tubo kaj ŝpinu ĝin mallonge

Sennaturigi kaj diluu Olink® Library al la fina ŝarĝa koncentriĝo
Dum ĉi tiu paŝo, la diluita Biblioteko Olink estas denaturita kaj plue diluita al la fina ŝarĝa koncentriĝo.

Preparu benkon

• Dil Tubo, preparita en antaŭa paŝo
• 0.2 N NaOH-diluo, freŝe preparita en antaŭa paŝo
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) diluo, preparita en antaŭa paŝo
• Hibridiga bufro 1 (HT1) inkluzivita en la NextSeq™ Akcesoraĵa Skatolo v2
• 2x Mikrocentrifugaj tuboj (1.5 ml kaj 2 ml)
• Manaj pipetoj (0.5-10 kaj 100-1000 μL)
• Filtrila pipetkonsiletoj

Antaŭ ol vi komencu

• Degelu la frostitan HT1-bufron ĉe ĉambra temperaturo. Konservu je +4 °C ĝis uzo.
• Marku la novan mikrocentrifugan tubon de 1.5 mL: "Den" (por la denaturata Biblioteko).
• Marku la novan mikrocentrifugan tubon de 2 mL: "Seq" (por la preta por ŝargi Biblioteko).

Instrukcioj

1. Transloku 5 μL de la Dil-Tubo al la Den-Tubo.
2. Aldonu 5 μL de 0.2 N NaOH al la Den Tubo.
3. Vortigu la Den Tubon kaj ŝpinu ĝin mallonge.
4. Kovu la Den Tubon dum 5 minutoj ĉe ĉambra temperaturo por denaturigi la Bibliotekon.
5. Aldonu 5 μL da 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) al la Den Tube por neŭtraligi la reagon.
6. Vortigu la Den Tubon kaj ŝpinu ĝin mallonge.
7. Aldonu 985 μL da antaŭmalvarmita HT1 al la Den Tubo.
8. Vortigu la Den Tubon kaj ŝpinu ĝin mallonge. La tubo povas esti konservita je +4 °C ĝis uzo (la sama tago).
9. Transloku 205 μL de la Den Tubo al la Seq Tube.
10. Aldonu 1095 μL da antaŭmalvarmita HT1 al la Seq Tube.
11. Inversu la Seq-Tubon por miksi la reactivojn kaj ŝpini ĝin mallonge. La fina ŝarĝa volumo estas 1.3 ml.
12. Tuj daŭrigu 2.5 Faru Olink®-sekvencan kuron.

Faru Olink®-sekvencan kuron

Dum ĉi tiu paŝo, la bufrokartoĉo, la fluĉelo kaj la preta reakciaĵkartoĉo enhavanta la Olink-Bibliotekon estas ŝarĝitaj en la NextSeq 550, kaj la sinsekva kuro estas komencita uzante la Olink kutiman recepton.

Preparu benkon

• Seq Tube (kun preta por ŝargi Biblioteko), preparita en antaŭa paŝo
• 1x NextSeq™ 500/550 Altprodukta Reakciga Kartoĉo v2, preparita en antaŭa paŝo
• 1x NextSeq™ 500/550 Alta Eliga Flua Ĉelo v2.5, preparita en antaŭa paŝo
• 1x NextSeq™ 500/550 Buffer Kartoĉo v2 (75 cikloj), ĉe ĉambra temperaturo

Agordu sinsekvajn kurajn parametrojn
Dum ĉi tiu paŝo, sinsekvaj kurparametroj estas elektitaj sur la NextSeq™ 550.

1. Sur la NextSeq™ 550 Hejma ekrano, elektu Eksperimenton.
2. Sur la ekrano Elektu Teston, elektu Sekvencon.
3. En la paĝo Run Setup, elektu Manan rulreĝimon kaj poste Sekva.
4. Agordu la kurajn parametrojn jene:
   • En la kampo Kura Nomo, enigu unikan eksperimentan ID.
   • En la kampo ID de Biblioteko, enigu la ID de la Biblioteko, kiun vi funkcias (laŭvola).
   • En la kampo Lego-Tipo, elektu la opcion Ununura Legado.
   • Enigu la nombron da cikloj jene:
     • Legu 1: 24
     • Indekso 1: 0
     • Indekso 2: 0
     • Legu 2: 0
   • Tenu la markobutonon por kutimaj enkondukoj neelektita.
   • Agordu la eligan dosierujon por la nunaj kuritaj krudaj datumoj. Elektu Folumi por ŝanĝi la eligan dosierujon.
5. Ne starigu Sample Sheet.
6. Elektu Purigi konsumeblajn por ĉi tiu kuro.
7. Elektu Sekva.

Ŝarĝu fluĉelon en NextSeq™ 550

1. Forigu la uzitan fluĉelon de la antaŭa kuro.
2. Metu la novan pretan fluĉelon sur la stage.
3. Elektu Ŝarĝi. La pordo estas aŭtomate fermita.
4. Kiam la fluo-ĉela ID aperas sur la ekrano kaj la sensiloj estas verdaj, elektu Sekva

Malplenigu la ujon de reakciilo
AVERTO: Ĉi tiu aro de reakciiloj enhavas eble danĝerajn kemiaĵojn. Portu taŭgan protektan ekipaĵon kaj forĵetu uzitajn reakcilojn laŭ aplikeblaj normoj. Por pliaj informoj, raportu al la Sistema Gvidilo Illumina NextSeq 550.

1. Malfermu la pordon de la bufra kupeo, forigu la eluzitan ujon de reakciiloj el la malsupra kupeo kaj forigu la enhavon laŭ aplikeblaj normoj.
2. Glitu la malplenan reakciaĵujon reen en la malsupran bufran kupeon. Aŭdebla klako indikas, ke la ujo estas ĝuste metita.

Ŝarĝu bufran kartoĉon

1. Forigu la uzitan bufran kartoĉon el la supra bufrokupeo kaj forigu la enhavon laŭ aplikeblaj normoj.
2. Glitu novan bufran kartoĉon en la supran bufran kupeon. Aŭdebla klako indikas, ke la kartoĉo estas ĝuste metita. Certiĝu, ke la bufrokartoĉa ID aperas sur la ekrano kaj ke la sensiloj estas verdaj.
3. Fermu la pordon de la bufro-kupeo kaj elektu Sekva.

Ŝarĝu reakcian kartoĉon

1. Malfermu la pordon de la kupeo de reakciilo, forigu la uzatan reakcian kartoĉon kaj forigu la neuzatan enhavon laŭ aplikeblaj normoj. La rezervujo ĉe pozicio 6 estas forprenebla por faciligi sekuran forigon.
2. Trapiku la sigelon de la rezervujo numero 10 etikedita kiel "Ŝarĝu Biblioteko Ĉi tie" per pura 1 mL pipetpinto.
3. Ŝarĝu 1.3 mL la Bibliotekon Olink de la Seq Tube en la rezervujon #10 etikedita kiel "Ŝarĝu Biblioteko Ĉi tie".
4. Glitu la novan reakcian kartoĉon en la reakcigan kupeon kaj fermu la reakcigan pordon.
5. Elektu Ŝarĝi kaj atendu ĉirkaŭ 30 sekundojn ĝis la reakciiga kartoĉo-ID aperos sur la ekrano kaj la sensiloj estas verdaj.
6. El la fallisto de Recepto, elektu la recepton opcion [Persona] "Olink_NSQ550_HighOutput_V1".
7. Elektu Sekva.

Komencu sinsekvan kuron

1. Konfirmu la kurajn parametrojn montritajn sur la Review ekrano. Por redakti iujn ajn parametrojn, premu Reen por reveni al la ekrano Run Setup.
2. Elektu Poste. La kurado komenciĝas post aŭtomata antaŭkura kontrolo. La sinsekva rultempo estas proksimume 7h30 min.
3. Purigu la laborareon.

NOTO: Kiam la sinsekva kuro estas finita, la softvaro iniciatas aŭtomatan postkuran lavon uzante la lavsolvojn disponigitajn en la bufrokartoĉo kaj la NaOCl disponigitan en la reakciaĵkartoĉo. Ĉi tiu lavado daŭras proksimume 90 minutojn. La Hejma butono fariĝas aktiva post la lavado estas finita. Uzitaj kartoĉoj kaj fluĉelo povas esti lasitaj modloko ĝis la sekva kuro.

Monitoru la progreson de la kurado
Olink utiligas NGS kiel legaĵon por kvantigi la kvanton de konata sekvenco por taksi la koncentriĝon de antaŭfiksita proteino en s.amples (rilate al aliaj samples). Datuma kvalito de ĉiu Esploru-sekvenca kuro estas ĉefe determinita de QC-parametroj unikaj al Olink-teknologio. Tial, normaj kvalitkontrolaj metrikoj uzitaj en konvenciaj NGS, kiel ekzemple Q-poentaro, estas malpli kritikaj.

Historio de revizioj

Versio	Dato	Priskribo
1.1	2021-12-13	Redakciaj ŝanĝoj
1.0	2021-12-01	Nova

www.olink.com
Nur Por Esplora Uzo. Ne por Uzo en Diagnozaj Proceduroj.
Ĉi tiu produkto inkluzivas permesilon por nekomerca uzo de Olink-produktoj. Komercaj uzantoj povas postuli pliajn permesilojn. Bonvolu kontakti Olink
Proteomics AB por detaloj. Ne ekzistas garantioj, esprimitaj aŭ implicitaj, kiuj etendiĝas preter ĉi tiu priskribo. Olink Proteomics AB ne respondecas pri posedaĵdamaĝo, persona vundo aŭ ekonomia perdo kaŭzita de ĉi tiu produkto.
La sekva varmarko estas posedata de Olink Proteomics AB: Olink®.
Ĉi tiu produkto estas kovrita de pluraj patentoj kaj patentpetoj disponeblaj ĉe https://www.olink.com/patents/.
© Kopirajto 2021 Olink Proteomics AB. Ĉiuj triapartneraj varmarkoj estas la posedaĵo de siaj respektivaj posedantoj. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Upsalo, Svedio
1192, v1.1, 2021-12-13

Dokumentoj/Rimedoj

Olink Esploru Sekvencadon uzante NextSeq 550 [pdf] Uzanto-manlibro Esploru Sekvencadon per NextSeq 550, Esploru Sekvencadon, uzante NextSeq 550, NextSeq 550

Referencoj

• Uzanto Manlibro