NextSeq 550 を使用した Olink Explore シーケンシング
導入
使用目的
Olink® Explore は、ヒトタンパク質バイオマーカー発見のためのマルチプレックス イムノアッセイ プラットフォームです。 この製品は研究目的でのみ使用することを目的としており、診断手順での使用は意図していません。 実験室での作業は、訓練を受けた実験室スタッフのみが行うものとします。 データ処理は、訓練を受けたスタッフのみが実行するものとします。 この結果は、研究者が他の臨床または検査所見と併せて使用することを意図しています。
このマニュアルについて
このユーザーマニュアルは、Illumina® NextSeq™ 550 で Olink® Explore Libraries をシーケンスするために必要な指示を提供します。指示には厳密かつ明示的に従わなければなりません。 実験室の手順全体で逸脱すると、データが損なわれる可能性があります。 ラボのワークフローを開始する前に、Olink® Explore Over を参照してください。view 必要な試薬、機器、およびドキュメントに関する情報を含む、プラットフォームの紹介のためのユーザーマニュアルview ラボのガイドラインだけでなく、ワークフローの。 Olink® Explore 試薬キットの実行方法については、該当する Olink® Explore ユーザー マニュアルを参照してください。 Olink® Explore シーケンス結果のデータ処理と分析については、Olink® MyData Cloud ユーザー ガイドを参照してください。 この資料に含まれるすべての商標および著作権は、特に明記されていない限り、Olink® Proteomics AB の所有物です。
テクニカルサポート
テクニカル サポートについては、Olink Proteomics にお問い合わせください。 support@olink.com.
実験室の指示
この章では、NextSeq™ 550/500 高出力キット v550 (2.5 サイクル) を使用して、NextSeq™ 75 で Olink ライブラリーをシーケンスする方法について説明します。 シーケンシングに使用されるプロトコルは、Illumina® NextSeq™ 550 用の Illumina® 標準 NGS ワークフローを適応させたものです。シーケンシングに進む前に、精製されたライブラリの品質が検証されていることを確認してください。 品質管理に関する指示については、該当する Olink Explore ユーザー マニュアルを参照してください。
シーケンス実行を計画する
NextSeq™ 550 High Output フローセルおよびランごとに、1 つの Olink ライブラリーをシーケンスできます。 異なる Olink Explore 試薬キットのシーケンスに必要な高出力フローセルとランの数を表 XNUMX に示します。複数のランが必要な場合は、このマニュアルに記載されている手順を繰り返してください。
表 1.シーケンス実行計画:
| Olink® Explore 試薬キット | Olink ライブラリの数 | フローセルとランの数 |
| Olink® Explore 384 試薬キット | 1 | 1 |
| Olink® Explore 4 x 384 試薬キット | 4 | 4 |
| Olink® Explore 1536 試薬キット | 4 | 4 |
| Olink® Explore 拡張試薬キット | 4 | 4 |
| Olink® Explore 3072 試薬キット | 8 | 8 |
Olink®カスタムレシピをインストール
このステップでは、Olink® カスタム レシピが NextSeq™ 550 にインストールされます。このステップは、Olink シーケンス ランを初めて実行する前に XNUMX 回だけ実行する必要があります。
注記： Olink カスタムレシピは、NextSeq™ 500/550 High Output Kits および NextSeq™ Control Software 4.0 でのみ機能します。
- Olink カスタム レシピ Olink_NSQ550_HighOutput_V1 を解凍し、NextSeq™ 550 装置の次のフォルダーに配置します: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\。
- [システムのカスタマイズ] > [機器の管理] で、カスタム レシピを有効にします。 選択されていない場合、実行セットアップ中にカスタム レシピ オプションは表示されません。
注記： NCS 4.0 ソフトウェア バージョンでは、カスタム レシピを選択するオプションは、以前のセットアップ ページではなく、試薬カートリッジがロードされた後にのみ表示されます。
注記： カスタムレシピを許可するには、実行を手動モードに設定する必要があります。
シーケンス試薬の準備
このステップでは、クラスタリング試薬とシーケンス試薬を含む試薬カートリッジが解凍され、フローセルが準備されます。
試薬カートリッジの準備
警告： 試薬カートリッジには潜在的に危険な化学物質が含まれています。 適切な保護具を着用し、適用される基準に従って使用済み試薬を廃棄してください。 詳細については、Illumina NextSeq 550 System Guide (ドキュメント #15069765) を参照してください。
ベンチの準備
- 1x NextSeq™ 500/550 高出力試薬カートリッジ v2 (75 サイクル)。
説明書
- 凍結した試薬カートリッジを室温の水に半分浸し、1 時間解凍します。 カートリッジのすべての試薬リザーバーが完全に解凍されていることを確認してください。
注記： 便宜上、前日にカートリッジを解凍し、4 °C で一晩保存します。 この温度で、試薬は最長 XNUMX 週間安定です。 - ペーパー タオルでカートリッジ ベースを完全に乾かし、必要に応じて糸くずの出ないティッシュでフォイル シールを拭き取ります。
- カートリッジを XNUMX 回逆さにして、解凍した試薬を完全に混合します。
- ベンチでカートリッジを軽くたたき、気泡を取り除きます。 カートリッジを 4 時間以内に使用する場合は、カートリッジを室温で保管してください。
フローセルの準備
ベンチの準備
- NextSeq™ 1/500 高出力フローセル v550 x 2.5。
説明書
- 冷蔵したフローセルを室温に 30 分間置きます。
- 新しいパウダー フリーの手袋を着用します (フロー セルのガラス面の汚染を避けるため)。
- フローセルを装置にロードする準備ができたら、パッケージとプラスチッククラムシェルからフローセルを取り出します。
- フローセルを点検します。 ガラスの表面に粒子やほこりが見える場合は、該当する表面を糸くずの出ないイソプロピル アルコール ワイプで拭き、糸くずの出にくいラボ ティッシュで乾かします。
シーケンシング用に Olink® Library を準備する
このステップでは、NaOH および Tris-HCl 希釈液が調製され、精製および品質管理された Olink ライブラリーが連続ステップで希釈および変性されます。
NaOH 希釈を準備します。
NaOH 希釈液は、ライブラリーの変性に使用されます。
ベンチの準備
- 1 N NaOH ストック
- ミリキューウォーター
- 1x マイクロ遠心チューブ (1.5 mL)
- 手動ピペット (10 ～ 100 μL)
- フィルターピペットチップ
始める前に
マイクロ遠心チューブ「NaOH」をマークします。
説明書
- 表 0.2 に従って、NaOH チューブで 2 N NaOH 希釈液を準備します。
- NaOH Tube を徹底的にボルテックスし、スピンダウンします。 12時間以内にご使用ください。
表 2. 0.2 N NaOH 希釈
| 試薬 | 容量（μL） |
| ミリキューウォーター | 80 |
| 1 N NaOH ストック | 20 |
2.4.2 Tris-HCl 希釈液の準備
Tris-HCl 希釈液は、変性ライブラリーを中和するために使用されます。
ベンチの準備
- 1 M Tris-HCl pH 7.0 ストック (Trizma® 塩酸塩溶液)
- ミリキューウォーター
- 1x マイクロ遠心チューブ (1.5 mL)
- 手動ピペット (10 ～ 100 μL)
- フィルターピペットチップ
始める前に
- マイクロ遠心チューブに「Tris-HCl」と印を付けます
説明書
- 表 200 に従って、Tris-HCl チューブで 3 mM Tris-HCl 希釈を準備します。
- Tris-HCl チューブを十分にボルテックスし、スピンダウンします。
表 3. 200 mM Tris-HCl 希釈:
| 試薬 | 容量（μL） |
| ミリキューウォーター | 80 |
| 1M Tris-HCl pH 7.0 ストック (Trizma® 塩酸塩溶液) | 20 |
Olink® ライブラリーの希釈
このステップでは、精製および品質管理された Olink ライブラリが 1:33 に希釈されます。
ベンチの準備
- 適切な Olink Explore ユーザー マニュアルに従って準備されたリブ チューブ
- ミリキューウォーター
- 1x マイクロ遠心チューブ (1.5 mL)
- 手動ピペット (0.5 ～ 10 および 100 ～ 1000 μL)
- フィルターピペットチップ
始める前に
- Lib Tube が凍結している場合は解凍してください。
- 新しい微量遠心管に印を付けます:「Dil」。
説明書
- 96 μL の MilliQ 水を Dil Tube に追加します。
- Lib Tube をボルテックスし、短時間スピンダウンします。
- Lib Tube から 3 μL を Dil Tube に移します。
- ディルチューブをボルテックスし、短時間スピンダウンします
Olink® Library を最終ローディング濃度に変性および希釈します
このステップでは、希釈した Olink Library を変性させ、最終ローディング濃度までさらに希釈します。
ベンチの準備
- 前のステップで用意したディル チューブ
- 前のステップで新たに調製した 0.2 N NaOH 希釈液
- 前のステップで調製した 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) 希釈液
- NextSeq™ アクセサリ ボックス v1 に含まれるハイブリダイゼーション バッファー 1 (HT2)
- 2x マイクロ遠心チューブ (1.5 mL および 2 mL)
- 手動ピペット (0.5 ～ 10 および 100 ～ 1000 μL)
- フィルターピペットチップ
始める前に
- 凍結した HT1 バッファーを室温で解凍します。 使用するまで +4 ° C で保存します。
- 新しい 1.5 mL マイクロ遠心チューブをマークします:「Den」(変性ライブラリ用)。
- 新しい 2 mL 微量遠心管にマークを付けます:「Seq」(ライブラリをロードする準備ができているため)。
説明書
- Dil Tube から Den Tube に 5 μL を移します。
- Den Tube に 5 N NaOH の 0.2 μL を追加します。
- Den Tube をボルテックスし、短時間スピンダウンします。
- Den Tube を室温で 5 分間インキュベートし、ライブラリーを変性させます。
- 反応を中和するデン チューブに 5 mM Tris-HCl (pH 200) の 7.0 μL を追加します。
- Den Tube をボルテックスし、短時間スピンダウンします。
- 985 μL の予冷済み HT1 をデン チューブに追加します。
- Den Tube をボルテックスし、短時間スピンダウンします。 チューブは、使用するまで +4 ° C で保存できます (同日)。
- Den Tube から 205 μL を Seq Tube に移します。
- Seq チューブに 1095 μL の予冷済み HT1 を追加します。
- Seq Tube を反転して試薬を混合し、短時間スピンダウンします。 最終的なローディング ボリュームは 1.3 mL です。
- すぐに 2.5 Olink® シーケンスランの実行に進みます。
Olink® シーケンスランを実行する
このステップでは、バッファ カートリッジ、フロー セル、および Olink ライブラリを含む準備済みの試薬カートリッジが NextSeq 550 にロードされ、Olink カスタム レシピを使用してシーケンス実行が開始されます。
ベンチの準備
- 前のステップで準備した Seq Tube (ライブラリをロードする準備が整った状態)
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2、前のステップで準備
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5、前のステップで準備
- 1x NextSeq™ 500/550 Buffer Cartridge v2 (75 サイクル)、室温
シーケンス実行パラメーターの設定
このステップでは、NextSeq™ 550 でシーケンス実行パラメーターが選択されます。
- NextSeq™ 550 のホーム画面で、実験を選択します。
- [アッセイの選択] 画面で、[シーケンス] を選択します。
- [Run Setup] ページで、[Manual run mode] を選択してから [Next] を選択します。
- 実行パラメーターを次のように設定します。
- [実行名] フィールドに、一意の実験 ID を入力します。
- [ライブラリ ID] フィールドに、実行しているライブラリの ID を入力します (オプション)。
- [読み取りタイプ] フィールドで、[単一読み取り] オプションを選択します。
- 次のようにサイクル数を入力します。
- 読み1:24
- インデックス1：0
- インデックス2：0
- 読み2:0
- カスタムプライマーのチェックボックスは選択しないでください。
- 現在の実行生データの出力フォルダーの場所を設定します。 [参照] を選択して、出力フォルダーの場所を変更します。
- Sを設定しないでくださいampルシート。
- この実行の消耗品をパージするを選択します。
- 「次へ」を選択します。
フローセルを NextSeq™ 550 にロードする
- 前回の実行で使用したフロー セルを取り外します。
- 新しく準備したフローセルを s に置きますtage.
- [読み込み] を選択します。 ドアは自動的に閉まります。
- フローセル ID が画面に表示され、センサーが緑色でチェックされたら、[次へ] を選択します。
試薬容器を空にする
警告： この試薬セットには、潜在的に危険な化学物質が含まれています。 適切な保護具を着用し、適用される基準に従って使用済み試薬を廃棄してください。 詳細については、イルミナ NextSeq 550 システムガイドを参照してください。
- バッファー コンパートメントのドアを開き、下部コンパートメントから使用済み試薬コンテナーを取り出し、該当する基準に従って内容物を廃棄します。
- 空の試薬容器を下部バッファー コンパートメントにスライドさせて戻します。 カチッという音がして、コンテナが正しく配置されたことを示します。
バッファーカートリッジのロード
- 使用済みのバッファー カートリッジを上部バッファー コンパートメントから取り出し、該当する基準に従って内容物を廃棄します。
- 新しいバッファー カートリッジを上部バッファー コンパートメントにスライドさせます。 カチッという音がして、カートリッジが正しく配置されたことを示します。 バッファーカートリッジ ID が画面に表示され、センサーが緑色でチェックされていることを確認します。
- バッファー コンパートメントのドアを閉じて、[次へ] を選択します。
試薬カートリッジのロード
- 試薬コンパートメントのドアを開け、使用済みの試薬カートリッジを取り出し、適用される基準に従って未使用の内容物を廃棄します。 位置 6 のリザーバーは取り外し可能で、安全に廃棄できます。
- きれいな 10 mL ピペット チップで「Load Library Here」というラベルの付いたリザーバー #1 のシールに穴を開けます。
- 1.3 mL の Olink ライブラリを Seq チューブからリザーバー #10 にロードし、「ここにライブラリをロード」というラベルを付けます。
- 新しい試薬カートリッジを試薬コンパートメントにスライドさせ、試薬コンパートメント ドアを閉じます。
- ロードを選択し、試薬カートリッジ ID が画面に表示され、センサーが緑色でチェックされるまで 30 秒ほど待ちます。
- レシピドロップダウンリストから、[カスタム]「Olink_NSQ550_HighOutput_V1」レシピオプションを選択します。
- 「次へ」を選択します。
シーケンス実行を開始
- Re に表示される実行パラメーターを確認します。view 画面。 パラメータを編集するには、Back を押して Run Setup 画面に戻ります。
- [次へ] を選択します。 自動プレランチェックの後にランが開始されます。 シーケンス実行時間は約 7 時間 30 分です。
- 作業エリアを清掃してください。
注記： シーケンス実行が完了すると、ソフトウェアは、バッファー カートリッジに含まれる洗浄液と試薬カートリッジに含まれる NaOCl を使用して、実行後の自動洗浄を開始します。 この洗浄には約 90 分かかります。 洗浄が完了すると、ホームボタンが有効になります。 使用済みのカートリッジとフローセルは、次の実行までそのままにしておくことができます。
実行の進行状況を監視する
Olink は既知の配列の量を定量化するための読み出しとして NGS を使用して、特定のタンパク質の濃度を s で推定します。amples (他の sampレ）。 各Exploreシーケンシングランからのデータ品質は、主にOlinkテクノロジーに固有のQCパラメーターによって決定されます。 したがって、Q スコアなど、従来の NGS で使用される標準的な品質管理指標はそれほど重要ではありません。
改訂履歴
| バージョン | 日付 | 説明 |
| 1.1 | 2021-12-13 | 編集上の変更 |
| 1.0 | 2021-12-01 | 新しい |
www.olink.com
研究目的のみ。 診断手順には使用しないでください。
この製品には、Olink 製品の非商用使用のライセンスが含まれています。 商用ユーザーは、追加のライセンスが必要になる場合があります。 オリンクまでご連絡ください
詳しくはプロテオミクスABまで。 明示または黙示を問わず、この説明を超える保証はありません。 Olink Proteomics AB は、この製品に起因する物的損害、人身傷害、または経済的損失について責任を負いません。
次の商標は、Olink Proteomics AB が所有しています: Olink®。
この製品は、次の Web サイトで入手可能な複数の特許および特許出願によって保護されています。 https://www.olink.com/patents/.
© 著作権 2021 Olink Proteomics AB. すべてのサードパーティの商標は、それぞれの所有者の財産です。 Olink Proteomics、Dag Hammarskjölds väg 52B、SE-752 37 ウプサラ、スウェーデン
1192, v1.1, 2021-12-13
ドキュメント / リソース
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NextSeq 550 を使用した Olink Explore シーケンシング [pdf] ユーザーマニュアル NextSeq 550 を使用してシーケンシングを調べる、NextSeq 550 を使用してシーケンシングを調べる、NextSeq 550 |
