Olink Explore Sequencing mitjançant NextSeq 550
Introducció
Ús previst
Olink® Explore és una plataforma d'immunoassaig múltiple per al descobriment de biomarcadors de proteïnes humanes. El producte està pensat només per a ús en recerca i no per a procediments de diagnòstic. El treball de laboratori només serà realitzat per personal de laboratori format. El tractament de les dades només el realitzarà personal format. Els resultats estan destinats a ser utilitzats pels investigadors juntament amb altres troballes clíniques o de laboratori.
Sobre aquest manual
Aquest manual d'usuari proporciona les instruccions necessàries per seqüenciar les biblioteques Olink® Explore a Illumina® NextSeq™ 550. Les instruccions s'han de seguir de manera estricta i explícita. Qualsevol desviació al llarg dels passos del laboratori pot donar lloc a dades deteriorades. Abans d'iniciar el flux de treball del laboratori, consulteu l'Olink® Explore Overview Manual de l'usuari per a una introducció a la plataforma, inclosa informació sobre reactius, equips i documentació necessària, i mésview del flux de treball, així com les directrius del laboratori. Per obtenir instruccions sobre com executar els kits de reactius Olink® Explore, consulteu el manual d'usuari d'Olink® Explore aplicable. Per al processament de dades i l'anàlisi dels resultats de la seqüència d'Olink® Explore, consulteu la Guia d'usuari d'Olink® MyData Cloud. Totes les marques comercials i els drets d'autor continguts en aquest material són propietat d'Olink® Proteomics AB, tret que s'indiqui el contrari.
Suport tècnic
Per obtenir suport tècnic, poseu-vos en contacte amb Olink Proteomics a support@olink.com.
Instruccions de laboratori
Aquest capítol proporciona instruccions sobre com seqüenciar les biblioteques Olink al NextSeq™ 550 mitjançant el kit d'alta sortida NextSeq™ 500/550 v2.5 (75 cicles). El protocol utilitzat per a la seqüenciació és una adaptació del flux de treball NGS estàndard Illumina® per a Illumina® NextSeq™ 550. Abans de procedir a la seqüenciació, assegureu-vos que s'ha verificat la qualitat de la biblioteca purificada. Consulteu el manual d'usuari d'Olink Explore aplicable per obtenir instruccions sobre el control de qualitat.
Planifica l'execució de la seqüenciació
Es pot seqüenciar una biblioteca Olink per cèl·lula de flux NextSeq™ 550 High Output i per tirada. A la taula 1 es descriu el nombre de cel·les de flux d'alt rendiment i d'execucions necessàries per seqüenciar els diferents kits de reactius Olink Explore. Si cal més d'una prova, repetiu les instruccions descrites en aquest manual.
Taula 1. Planificació d'execució de seqüenciació:
| Kit de reactius Olink® Explore | Nombre de biblioteques Olink | Nombre de cel·les de flux i curses |
| Kit de reactius Olink® Explore 384 | 1 | 1 |
| Kit de reactius Olink® Explore 4 x 384 | 4 | 4 |
| Kit de reactius Olink® Explore 1536 | 4 | 4 |
| Kit de reactius d'expansió Olink® Explore | 4 | 4 |
| Kit de reactius Olink® Explore 3072 | 8 | 8 |
Instal·leu la recepta personalitzada Olink®
Durant aquest pas, la recepta personalitzada d'Olink® s'instal·la al NextSeq™ 550. Aquest pas només s'ha de realitzar una vegada, abans de realitzar una execució de seqüenciació Olink per primera vegada.
NOTA: La recepta personalitzada d'Olink només funcionarà amb els kits d'alta sortida NextSeq™ 500/550 i el programari de control NextSeq™ 4.0
- Descomprimiu i col·loqueu la recepta personalitzada d'Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 a la carpeta següent de l'instrument NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
- A Personalització del sistema > Gestiona l'instrument, activeu Receptes personalitzades. Si no se selecciona, l'opció de recepta personalitzada no apareixerà durant la configuració de l'execució.
NOTA: A la versió del programari NCS 4.0, l'opció de seleccionar una recepta personalitzada només es produirà després de carregar el cartutx de reactius, no a la pàgina de configuració anterior.
NOTA: L'execució s'ha de configurar en mode manual per permetre receptes personalitzades.
Preparar reactius de seqüenciació
Durant aquest pas, el cartutx de reactius que conté reactius d'agrupació i seqüenciació es descongela i es prepara la cel·la de flux.
Prepareu el cartutx de reactius
ADVERTIMENT: El cartutx de reactiu conté productes químics potencialment perillosos. Utilitzeu l'equip de protecció adequat i descarteu els reactius utilitzats d'acord amb les normes aplicables. Per obtenir més informació, consulteu la Guia del sistema Illumina NextSeq 550 (document núm. 15069765).
Prepara el banc
- 1x Cartutx de reactius d'alta sortida NextSeq™ 500/550 v2 (75 cicles).
Instruccions
- Col·loqueu el cartutx de reactiu congelat mig submergit en aigua temperada i deixeu-lo descongelar durant 1 hora. Assegureu-vos que tots els dipòsits de reactius dels cartutxos estiguin completament descongelats.
NOTA: Per comoditat, descongeleu el cartutx el dia abans i guardeu-lo durant la nit a 4 °C. A aquesta temperatura, els reactius són estables fins a una setmana. - Assequeu bé la base del cartutx amb una tovallola de paper i assequeu els segells d'alumini amb un mocador sense pelusa si cal.
- Inverteix el cartutx deu vegades per barrejar bé els reactius descongelats.
- Toqueu el cartutx suaument al banc per eliminar les bombolles d'aire. Emmagatzemeu el cartutx a temperatura ambient si s'utilitzarà en 4 hores.
Prepareu la cel·la de flux
Prepara el banc
- 1x Cèl·lula de flux d'alta sortida NextSeq™ 500/550 v2.5.
Instruccions
- Porta la cel·la de flux refrigerada a temperatura ambient durant 30 minuts.
- Poseu-vos guants nous sense pols (per evitar contaminar la superfície de vidre de la cel·la de flux).
- Quan estigui llest per carregar la cel·la de flux a l'instrument, traieu la cel·la de flux del paquet i la closca de plàstic.
- Inspeccioneu la cel·la de flux. Si hi ha partícules o pols a qualsevol de les superfícies de vidre, netegeu la superfície aplicable amb una tovallola d'alcohol isopropílic sense pelusa i assequeu-la amb un mocador de laboratori sense pelusa.
Prepareu la biblioteca Olink® per a la seqüenciació
Durant aquest pas, es preparen dilucions de NaOH i Tris-HCl i la biblioteca Olink purificada i controlada de qualitat es dilueix i es desnaturalitza en passos seqüencials.
Prepareu la dilució de NaOH
La dilució de NaOH s'utilitza per desnaturalitzar les biblioteques.
Prepara el banc
- Stock de NaOH 1 N
- Aigua MilliQ
- 1x tub de microcentrífuga (1.5 ml)
- Pipeta manual (10-100 μL)
- Filtre les puntes de pipeta
Abans de començar
Marqueu el tub de microcentrífuga "NaOH".
Instruccions
- Prepareu una dilució de NaOH 0.2 N al tub de NaOH segons la taula 2.
- Agitar el tub de NaOH a fons i girar cap avall. Utilitzar en 12 hores.
Taula 2. Dilució de NaOH 0.2 N
| Reactiu | Volum (μl) |
| Aigua MilliQ | 80 |
| Stock de NaOH 1 N | 20 |
2.4.2 Preparar la dilució de Tris-HCl
La dilució de Tris-HCl s'utilitza per neutralitzar la biblioteca desnaturalitzada.
Prepara el banc
- Tris-HCl 1 M pH 7.0 (solució de clorhidrat de Trizma®)
- Aigua MilliQ
- 1x tub de microcentrífuga (1.5 ml)
- Pipeta manual (10-100 μL)
- Filtre les puntes de pipeta
Abans de començar
- Marqueu el tub de microcentrífuga "Tris-HCl"
Instruccions
- Prepareu una dilució de Tris-HCl de 200 mM al tub de Tris-HCl segons la taula 3.
- Agitar el tub Tris-HCl a fons i girar-lo cap avall.
Taula 3. Dilució Tris-HCl de 200 mM:
| Reactiu | Volum (μl) |
| Aigua MilliQ | 80 |
| Tris-HCl 1M pH 7.0 (solució de clorhidrat de Trizma®) | 20 |
Dilueix les biblioteques Olink®
Durant aquest pas, la biblioteca Olink purificada i controlada de qualitat es dilueix 1:33.
Prepara el banc
- Lib Tube, preparat segons el manual d'usuari d'Olink Explore aplicable
- Aigua MilliQ
- 1x tub de microcentrífuga (1.5 ml)
- Pipetes manuals (0.5-10 i 100-1000 μL)
- Filtre les puntes de pipeta
Abans de començar
- Descongela el tub Lib si està congelat.
- Marqueu el nou tub de microcentrífuga: "Dil".
Instruccions
- Afegiu 96 μL d'aigua MilliQ al tub Dil.
- Agitar el tub Lib i girar-lo cap avall breument.
- Transferiu 3 μL del tub Lib al tub Dil.
- Agitar el tub Dil i girar-lo cap avall breument
Desnaturalitzar i diluir Olink® Library fins a la concentració de càrrega final
Durant aquest pas, la biblioteca Olink diluïda es desnaturalitza i es dilueix encara més fins a la concentració de càrrega final.
Prepara el banc
- Dil Tube, preparat al pas anterior
- Dilució de NaOH 0.2 N, acabada de preparar al pas anterior
- Dilució de 200 mM de Tris-HCl (pH 7.0), preparada al pas anterior
- Buffer d'hibridació 1 (HT1) inclòs a la caixa d'accessoris NextSeq™ v2
- 2x tubs de microcentrífuga (1.5 ml i 2 ml)
- Pipetes manuals (0.5-10 i 100-1000 μL)
- Filtre les puntes de pipeta
Abans de començar
- Descongela el tampó HT1 congelat a temperatura ambient. Emmagatzemar a +4 °C fins al seu ús.
- Marqueu el nou tub de microcentrífuga d'1.5 ml: "Den" (per a la biblioteca desnaturalitzada).
- Marqueu el nou tub de microcentrífuga de 2 ml: "Seq" (per a la biblioteca llesta per carregar).
Instruccions
- Transferiu 5 μL del tub Dil al tub Den.
- Afegiu 5 μL de NaOH 0.2 N al tub Den.
- Agitar amb vòrtex el Den Tub i girar-lo cap avall breument.
- Incubeu el Den Tube durant 5 minuts a temperatura ambient per desnaturalitzar la biblioteca.
- Afegiu 5 μL de Tris-HCl 200 mM (pH 7.0) al tub Den per neutralitzar la reacció.
- Agitar amb vòrtex el Den Tub i girar-lo cap avall breument.
- Afegiu 985 μL de HT1 prerefrigerat al Den Tube.
- Agitar amb vòrtex el Den Tub i girar-lo cap avall breument. El tub es pot emmagatzemar a +4 °C fins al seu ús (el mateix dia).
- Transferiu 205 μl del tub Den al tub Seq.
- Afegiu 1095 μL de HT1 prerefrigerat al tub Seq.
- Inverteix el tub Seq per barrejar els reactius i gira-lo cap avall breument. El volum de càrrega final és d'1.3 ml.
- Continueu immediatament a 2.5 Realitzeu l'execució de seqüenciació Olink®.
Realitzeu l'execució de seqüenciació Olink®
Durant aquest pas, el cartutx de tampó, la cel·la de flux i el cartutx de reactius preparat que conté la biblioteca Olink es carreguen al NextSeq 550 i s'inicia l'execució de seqüenciació mitjançant la recepta personalitzada d'Olink.
Prepara el banc
- Seq Tube (amb biblioteca llesta per carregar), preparat al pas anterior
- 1x Cartutx de reactius d'alta sortida NextSeq™ 500/550 v2, preparat al pas anterior
- 1x NextSeq™ 500/550 Cèl·lula de flux d'alta sortida v2.5, preparada al pas anterior
- 1 cartutx de tampó NextSeq™ 500/550 v2 (75 cicles), a temperatura ambient
Configureu els paràmetres d'execució de seqüenciació
Durant aquest pas, els paràmetres d'execució de seqüenciació es seleccionen al NextSeq™ 550.
- A la pantalla d'inici del NextSeq™ 550, seleccioneu Experiment.
- A la pantalla Seleccionar assaig, seleccioneu Seqüència.
- A la pàgina Configuració d'execució, seleccioneu Mode d'execució manual i, a continuació, Següent.
- Configureu els paràmetres d'execució de la següent manera:
- Al camp Nom de l'execució, introduïu un identificador d'experiment únic.
- Al camp ID de la biblioteca, introduïu l'ID de la biblioteca que esteu executant (opcional).
- Al camp Tipus de lectura, seleccioneu l'opció de lectura única.
- Introduïu el nombre de cicles de la següent manera:
- Llegir 1:24
- Índex 1: 0
- Índex 2: 0
- Llegir 2:0
- Manteniu la casella de selecció dels imprimadors personalitzats sense seleccionar.
- Establiu la ubicació de la carpeta de sortida per a les dades en brut de l'execució actual. Seleccioneu Navega per canviar la ubicació de la carpeta de sortida.
- No configureu un Sample Full.
- Seleccioneu Purga consumibles per a aquesta execució.
- Seleccioneu Següent.
Carregueu la cel·la de flux a NextSeq™ 550
- Traieu la cel·la de flux usada de l'execució anterior.
- Col·loqueu la nova cel·la de flux preparada al stage.
- Seleccioneu Carrega. La porta es tanca automàticament.
- Quan l'ID de la cel·la de flux aparegui a la pantalla i els sensors estiguin marcats en verd, seleccioneu Següent
Buidar el recipient de reactius
ADVERTIMENT: Aquest conjunt de reactius conté productes químics potencialment perillosos. Utilitzeu l'equip de protecció adequat i descarteu els reactius utilitzats d'acord amb les normes aplicables. Per obtenir més informació, consulteu la Guia del sistema Illumina NextSeq 550.
- Obriu la porta del compartiment del tampó, traieu el contenidor de reactius gastats del compartiment inferior i elimineu-ne el contingut d'acord amb les normes aplicables.
- Torneu a lliscar el recipient de reactius buit al compartiment inferior del tampó. Un clic audible indica que el contenidor està col·locat correctament.
Carregueu el cartutx de memòria intermèdia
- Traieu el cartutx d'amortiment usat del compartiment superior i llenceu-ne el contingut d'acord amb les normes aplicables.
- Feu lliscar un cartutx amortidor nou al compartiment superior. Un clic audible indica que el cartutx està col·locat correctament. Assegureu-vos que l'ID del cartutx de memòria intermèdia aparegui a la pantalla i que els sensors estiguin marcats en verd.
- Tanqueu la porta del compartiment d'amortiment i seleccioneu Següent.
Carregueu el cartutx de reactius
- Obriu la porta del compartiment de reactius, traieu el cartutx de reactius usat i elimineu el contingut no utilitzat d'acord amb les normes aplicables. El dipòsit a la posició 6 és desmuntable per facilitar l'eliminació segura.
- Perforeu el segell del dipòsit número 10 etiquetat com a "Carrega la biblioteca aquí" amb una punta de pipeta neta d'1 ml.
- Carregueu 1.3 ml de la biblioteca Olink del tub Seq al dipòsit núm. 10 etiquetat com a "Carrega la biblioteca aquí".
- Feu lliscar el cartutx de reactius nou al compartiment de reactius i tanqueu la porta del compartiment de reactius.
- Seleccioneu Carrega i espereu uns 30 segons fins que l'ID del cartutx de reactius aparegui a la pantalla i els sensors es marquen en verd.
- A la llista desplegable Recepta, seleccioneu l'opció de recepta [Personalitzada] "Olink_NSQ550_HighOutput_V1".
- Seleccioneu Següent.
Inicieu la seqüenciació
- Confirmeu els paràmetres d'execució que es mostren al Review pantalla. Per editar qualsevol paràmetre, premeu Enrere per tornar a la pantalla de configuració d'execució.
- Seleccioneu Següent. L'execució comença després d'una comprovació prèvia automàtica. El temps d'execució de la seqüenciació és d'aproximadament 7h30 min.
- Netegeu la zona de treball.
NOTA: Quan s'ha completat l'execució de seqüenciació, el programari inicia un rentat posterior automàtic mitjançant les solucions de rentat que es proporcionen al cartutx de tampó i el NaOCl que es proporciona al cartutx de reactiu. Aquest rentat dura aproximadament 90 minuts. El botó d'inici s'activa un cop finalitzat el rentat. Els cartutxos usats i la cel·la de flux es poden deixar al seu lloc fins a la propera execució.
Supervisar el progrés de l'execució
Olink utilitza NGS com a lectura per quantificar la quantitat d'una seqüència coneguda per estimar la concentració d'una proteïna determinada en samples (en relació amb altres samples). La qualitat de les dades de cada execució de seqüenciació d'Explore està determinada principalment pels paràmetres de control de qualitat exclusius de la tecnologia Olink. Per tant, les mètriques de control de qualitat estàndard que s'utilitzen en NGS convencionals, com ara la puntuació Q, són menys crítiques.
Historial de revisions
| Versió | Data | Descripció |
| 1.1 | 2021-12-13 | Canvis editorials |
| 1.0 | 2021-12-01 | Nou |
www.olink.com
Només per a ús de recerca. No s'utilitza en procediments de diagnòstic.
Aquest producte inclou una llicència per a l'ús no comercial dels productes Olink. Els usuaris comercials poden requerir llicències addicionals. Poseu-vos en contacte amb Olink
Proteomics AB per a més detalls. No hi ha garanties, expresses o implícites, que s'estengui més enllà d'aquesta descripció. Olink Proteomics AB no es fa responsable dels danys a la propietat, lesions personals o pèrdues econòmiques causades per aquest producte.
La següent marca comercial és propietat d'Olink Proteomics AB: Olink®.
Aquest producte està cobert per diverses patents i sol·licituds de patent disponibles a https://www.olink.com/patents/.
© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Totes les marques comercials de tercers són propietat dels seus respectius propietaris. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Suècia
1192, v1.1, 2021-12-13
Documents/Recursos
 |
Olink Explore Sequencing mitjançant NextSeq 550 [pdfManual d'usuari Exploreu la seqüenciació amb NextSeq 550, Exploreu la seqüenciació, amb NextSeq 550, NextSeq 550 |
