Olink Explore Sequencing gamit ang NextSeq 550
Panimula
Sinasadyang paggamit
Ang Olink® Explore ay isang multiplex immunoassay platform para sa pagtuklas ng biomarker ng protina ng tao. Ang produkto ay inilaan para sa Paggamit Lamang sa Pananaliksik, at hindi para sa paggamit sa mga diagnostic procedure. Ang gawaing laboratoryo ay dapat lamang patakbuhin ng mga sinanay na kawani ng laboratoryo. Ang pagproseso ng data ay isasagawa lamang ng mga sinanay na kawani. Ang mga resulta ay nilalayong gamitin ng mga mananaliksik kasabay ng iba pang klinikal o laboratoryo na natuklasan.
Tungkol sa manwal na ito
Ang Manwal ng Gumagamit na ito ay nagbibigay ng mga tagubiling kailangan para i-sequence ang Olink® Explore Libraries sa Illumina® NextSeq™ 550. Ang mga tagubilin ay dapat na mahigpit at tahasang sundin. Ang anumang mga paglihis sa buong mga hakbang sa laboratoryo ay maaaring magresulta sa pagkasira ng data. Bago simulan ang daloy ng trabaho sa laboratoryo, kumonsulta sa Olink® Explore Overview User Manual para sa isang pagpapakilala sa platform, kabilang ang impormasyon tungkol sa mga reagents, kagamitan at dokumentasyong kailangan, tapos naview ng daloy ng trabaho, pati na rin ang mga alituntunin sa laboratoryo. Para sa mga tagubilin kung paano patakbuhin ang Olink® Explore Reagent Kits, sumangguni sa naaangkop na Olink® Explore User Manual. Para sa pagpoproseso ng data at pagsusuri ng mga resulta ng pagkakasunud-sunod ng Olink® Explore, sumangguni sa Olink® MyData Cloud User Guide. Ang lahat ng mga trademark at copyright na nilalaman sa materyal na ito ay pag-aari ng Olink® Proteomics AB, maliban kung iba ang nakasaad.
Teknikal na suporta
Para sa teknikal na suporta, makipag-ugnayan sa Olink Proteomics sa support@olink.com.
Mga tagubilin sa laboratoryo
Ang kabanatang ito ay nagbibigay ng mga tagubilin kung paano i-sequence ang Olink Libraries sa NextSeq™ 550 gamit ang NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles). Ang protocol na ginamit para sa sequencing ay isang adaptasyon ng Illumina® standard NGS workflow para sa Illumina® NextSeq™ 550. Bago magpatuloy sa sequencing, tiyaking na-verify na ang kalidad ng purified Library. Sumangguni sa naaangkop na Olink Explore User Manual para sa mga tagubilin tungkol sa kontrol sa kalidad.
Planuhin ang sequencing run
Ang isang Olink Library ay maaaring sequenced sa bawat NextSeq™ 550 High Output flow cell at bawat run. Ang bilang ng mga High Output flow cell at run na kinakailangan upang masunod ang iba't ibang Olink Explore Reagent Kits ay inilarawan sa Talahanayan 1. Kung higit sa isang run ang kinakailangan, ulitin ang mga tagubiling inilarawan sa manwal na ito.
Talahanayan 1.Pagpapaplano ng sequencing run:
| Olink® Explore Reagent Kit | Bilang ng Olink Libraries | Bilang ng (mga) flow cell at (mga) run |
| Olink® Explore 384 Reagent Kit | 1 | 1 |
| Olink® Explore 4 x 384 Reagent Kit | 4 | 4 |
| Olink® Explore 1536 Reagent Kit | 4 | 4 |
| Olink® Explore Expansion Reagent Kit | 4 | 4 |
| Olink® Explore 3072 Reagent Kit | 8 | 8 |
I-install ang custom na recipe ng Olink®
Sa hakbang na ito, ang custom na recipe ng Olink® ay naka-install sa NextSeq™ 550. Ang hakbang na ito ay kailangan lang gawin nang isang beses, bago isagawa ang isang Olink sequencing run sa unang pagkakataon.
TANDAAN: Ang custom na recipe ng Olink ay gagana lamang sa NextSeq™ 500/550 High Output Kits at ang NextSeq™ Control Software 4.0
- I-unzip at ilagay ang custom na recipe ng Olink na Olink_NSQ550_HighOutput_V1 sa sumusunod na folder ng NextSeq™ 550 na instrumento: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
- Sa ilalim ng System Customization > Manage Instrument, paganahin ang Mga Custom na Recipe. Kung hindi pipiliin, hindi lalabas ang opsyon sa custom na recipe sa panahon ng run setup.
TANDAAN: Sa bersyon ng software ng NCS 4.0, ang opsyon na pumili ng custom na recipe ay magaganap lamang pagkatapos ma-load ang reagent cartridge, hindi sa naunang pahina ng pag-setup.
TANDAAN: Ang pagtakbo ay dapat itakda sa manual mode upang payagan ang mga custom na recipe.
Maghanda ng mga sequencing reagents
Sa hakbang na ito, ang reagent cartridge na naglalaman ng clustering at sequencing reagents ay lasaw at ang flow cell ay inihanda.
Maghanda ng reagent cartridge
BABALA: Ang reagent cartridge ay naglalaman ng mga potensyal na mapanganib na kemikal. Magsuot ng sapat na kagamitang proteksiyon at itapon ang mga ginamit na reagents alinsunod sa mga naaangkop na pamantayan. Para sa karagdagang impormasyon, sumangguni sa Illumina NextSeq 550 System Guide (dokumento #15069765).
Maghanda ng bangko
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2 (75 cycle).
Mga tagubilin
- Ilagay ang nakapirming reagent cartridge na kalahating lubog sa tempered water at hayaang matunaw ito ng 1 oras. Siguraduhin na ang lahat ng reagent reservoir ng mga cartridge ay ganap na natunaw.
TANDAAN: Para sa kaginhawahan, lasawin ang cartridge sa araw bago at iimbak ito sa magdamag sa 4 °C. Sa temperatura na ito, ang mga reagents ay matatag hanggang isang linggo. - Patuyuin nang mabuti ang base ng cartridge gamit ang isang tuwalya ng papel at i-blot ang mga foil seal na tuyo gamit ang isang lint-free tissue kung kinakailangan.
- Baliktarin ang cartridge ng sampung beses upang maihalo nang husto ang mga natunaw na reagents sa loob.
- Dahan-dahang tapikin ang cartridge sa bench para alisin ang mga bula ng hangin. Itago ang cartridge sa temperatura ng silid kung ito ay gagamitin sa loob ng 4 na oras.
Ihanda ang flow cell
Maghanda ng bangko
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5.
Mga tagubilin
- Dalhin ang refrigerated flow cell sa room temperature sa loob ng 30 minuto.
- Magsuot ng bagong guwantes na walang pulbos (upang maiwasang makontamina ang salamin na ibabaw ng flow cell).
- Kapag handa nang i-load ang flow cell sa instrumento, alisin ang flow cell mula sa package at ang plastic clamshell.
- Suriin ang daloy ng cell. Kung ang particulate o alikabok ay nakikita sa alinman sa mga ibabaw ng salamin, linisin ang naaangkop na ibabaw gamit ang isang lint-free isopropyl alcohol na punasan at patuyuin ito ng isang low-lint lab tissue.
Ihanda ang Olink® Library para sa sequencing
Sa hakbang na ito, ang NaOH at Tris-HCl dilution ay inihahanda, at ang purified at quality controlled Olink Library ay diluted at denatured sa sunud-sunod na mga hakbang.
Maghanda ng NaOH dilution
Ang NaOH dilution ay ginagamit upang i-denature ang Mga Aklatan.
Maghanda ng bangko
- 1 N NaOH stock
- MilliQ na tubig
- 1x Microcentrifuge tube (1.5 mL)
- Manu-manong pipette (10-100 μL)
- I-filter ang mga tip sa pipette
Bago ka magsimula
Markahan ang microcentrifuge tube na "NaOH".
Mga tagubilin
- Maghanda ng 0.2 N NaOH dilution sa NaOH Tube ayon sa Talahanayan 2.
- I-vortex ang NaOH Tube nang maigi at paikutin pababa. Gamitin sa loob ng 12 oras.
Talahanayan 2. 0.2 N NaOH dilution
| Reagent | Dami (μL) |
| MilliQ na tubig | 80 |
| 1 N NaOH stock | 20 |
2.4.2 Maghanda ng Tris-HCl dilution
Ang Tris-HCl dilution ay ginagamit upang neutralisahin ang denaturated Library.
Maghanda ng bangko
- 1 M Tris-HCl pH 7.0 stock (Trizma® hydrochloride solution)
- MilliQ na tubig
- 1x Microcentrifuge tube (1.5 mL)
- Manu-manong pipette (10-100 μL)
- I-filter ang mga tip sa pipette
Bago ka magsimula
- Markahan ang microcentrifuge tube na "Tris-HCl"
Mga tagubilin
- Maghanda ng 200 mM Tris-HCl dilution sa Tris-HCl Tube ayon sa Talahanayan 3.
- I-Vortex ang Tris-HCl Tube nang lubusan at paikutin ito pababa.
Talahanayan 3. 200 mM Tris-HCl dilution:
| Reagent | Dami (μL) |
| MilliQ na tubig | 80 |
| 1M Tris-HCl pH 7.0 stock (Trizma® hydrochloride solution) | 20 |
Dilute ang Olink® Libraries
Sa hakbang na ito, ang nalinis at kinokontrol na kalidad na Olink Library ay natunaw sa 1:33.
Maghanda ng bangko
- Lib Tube, na inihanda ayon sa naaangkop na Olink Explore User Manual
- MilliQ na tubig
- 1x Microcentrifuge tube (1.5 mL)
- Mga manu-manong pipette (0.5-10 at 100-1000 μL)
- I-filter ang mga tip sa pipette
Bago ka magsimula
- I-thaw ang Lib Tube kung nagyelo.
- Markahan ang bagong microcentrifuge tube: "Dil".
Mga tagubilin
- Magdagdag ng 96 μL ng MilliQ na tubig sa Dil Tube.
- Vortex ang Lib Tube at paikutin ito saglit.
- Ilipat ang 3 μL mula sa Lib Tube papunta sa Dil Tube.
- Vortex ang Dil Tube at paikutin ito saglit
Denature at palabnawin ang Olink® Library hanggang sa huling konsentrasyon ng paglo-load
Sa hakbang na ito, ang diluted na Olink Library ay na-denatured at higit na natunaw sa huling konsentrasyon ng pag-load.
Maghanda ng bangko
- Dil Tube, inihanda sa nakaraang hakbang
- 0.2 N NaOH dilution, sariwang inihanda sa nakaraang hakbang
- 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) dilution, na inihanda sa nakaraang hakbang
- Hybridization buffer 1 (HT1) na kasama sa NextSeq™ Accessory Box v2
- 2x Microcentrifuge tubes (1.5 mL at 2 mL)
- Mga manu-manong pipette (0.5-10 at 100-1000 μL)
- I-filter ang mga tip sa pipette
Bago ka magsimula
- I-thaw ang frozen HT1 buffer sa temperatura ng kuwarto. Mag-imbak sa +4 °C hanggang gamitin.
- Markahan ang bagong 1.5 mL microcentrifuge tube: "Den" (para sa denaturated Library).
- Markahan ang bagong 2 mL microcentrifuge tube: "Seq" (para sa handa nang i-load ang Library).
Mga tagubilin
- Ilipat ang 5 μL mula sa Dil Tube papunta sa Den Tube.
- Magdagdag ng 5 μL ng 0.2 N NaOH sa Den Tube.
- Vortex ang Den Tube at paikutin ito saglit.
- I-incubate ang Den Tube sa loob ng 5 minuto sa temperatura ng silid upang ma-denature ang Library.
- Magdagdag ng 5 μL ng 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) sa Den Tube upang neutralisahin ang reaksyon.
- Vortex ang Den Tube at paikutin ito saglit.
- Magdagdag ng 985 μL ng prechilled HT1 sa Den Tube.
- Vortex ang Den Tube at paikutin ito saglit. Ang tubo ay maaaring itago sa +4 °C hanggang gamitin (sa parehong araw).
- Ilipat ang 205 μL mula sa Den Tube papunta sa Seq Tube.
- Magdagdag ng 1095 μL ng prechilled HT1 sa Seq Tube.
- Baligtarin ang Seq Tube upang paghaluin ang mga reagents at paikutin ito saglit. Ang huling dami ng paglo-load ay 1.3 mL.
- Kaagad na magpatuloy sa 2.5 Magsagawa ng Olink® sequencing run.
Magsagawa ng Olink® sequencing run
Sa hakbang na ito, ang buffer cartridge, ang flow cell at ang inihandang reagent cartridge na naglalaman ng Olink Library ay ini-load sa NextSeq 550, at ang sequencing run ay sinimulan gamit ang custom na recipe ng Olink.
Maghanda ng bangko
- Seq Tube (na may handang i-load ang Library), na inihanda sa nakaraang hakbang
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, na inihanda sa nakaraang hakbang
- 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, na inihanda sa nakaraang hakbang
- 1x NextSeq™ 500/550 Buffer Cartridge v2 (75 cycle), sa temperatura ng kuwarto
I-set up ang sequencing run parameters
Sa hakbang na ito, ang mga parameter ng sequencing run ay pinili sa NextSeq™ 550.
- Sa NextSeq™ 550 Home screen, piliin ang Eksperimento.
- Sa screen ng Select Assay, piliin ang Sequence.
- Sa pahina ng Run Setup, piliin ang Manual run mode at pagkatapos ay Susunod.
- I-set up ang mga parameter ng pagtakbo tulad ng sumusunod:
- Sa field ng Run Name, maglagay ng natatanging ID ng eksperimento.
- Sa field ng Library ID, ilagay ang ID ng Library na iyong pinapatakbo (opsyonal).
- Sa patlang na Uri ng Basahin, piliin ang opsyong Single Read.
- Ipasok ang bilang ng mga cycle tulad ng sumusunod:
- Basahin ang 1:24
- Index 1: 0
- Index 2: 0
- Basahin ang 2:0
- Panatilihing hindi napili ang checkbox para sa mga custom na primer.
- Itakda ang lokasyon ng output folder para sa kasalukuyang run raw data. Piliin ang Mag-browse upang baguhin ang lokasyon ng output folder.
- Huwag mag-set up ng Sample Sheet.
- Piliin ang Purge consumables para sa run na ito.
- Piliin ang Susunod.
I-load ang flow cell sa NextSeq™ 550
- Alisin ang ginamit na flow cell mula sa nakaraang run.
- Ilagay ang bagong inihandang flow cell sa stage.
- Piliin ang I-load. Awtomatikong sarado ang pinto.
- Kapag lumabas ang flow cell ID sa screen at ang mga sensor ay naka-check sa berde, piliin ang Susunod
Alisan ng laman ang lalagyan ng reagent
BABALA: Ang hanay ng mga reagents na ito ay naglalaman ng mga potensyal na mapanganib na kemikal. Magsuot ng sapat na kagamitan sa proteksyon at itapon ang mga ginamit na reagents alinsunod sa mga naaangkop na pamantayan. Para sa karagdagang impormasyon, sumangguni sa Illumina NextSeq 550 System Guide.
- Buksan ang pinto ng buffer compartment, alisin ang lalagyan ng mga ginamit na reagents mula sa ibabang bahagi, at itapon ang nilalaman alinsunod sa mga naaangkop na pamantayan.
- I-slide ang walang laman na reagent container pabalik sa lower buffer compartment. Ang isang naririnig na pag-click ay nagpapahiwatig na ang lalagyan ay inilagay nang tama.
I-load ang buffer cartridge
- Alisin ang ginamit na buffer cartridge mula sa itaas na buffer compartment at itapon ang nilalaman alinsunod sa mga naaangkop na pamantayan.
- Mag-slide ng bagong buffer cartridge sa itaas na buffer compartment. Ang isang naririnig na pag-click ay nagpapahiwatig na ang cartridge ay inilagay nang tama. Tiyaking lumalabas ang buffer cartridge ID sa screen at ang mga sensor ay naka-check sa berde.
- Isara ang pinto ng buffer compartment at piliin ang Susunod.
I-load ang reagent cartridge
- Buksan ang pinto ng reagent compartment, alisin ang ginamit na reagent cartridge, at itapon ang hindi nagamit na nilalaman alinsunod sa mga naaangkop na pamantayan. Ang reservoir sa posisyon 6 ay naaalis upang mapadali ang ligtas na pagtatapon.
- Tusukin ang seal ng reservoir #10 na may label na "I-load ang Library Here" na may malinis na 1 mL pipette tip.
- Mag-load ng 1.3 mL ang Olink Library mula sa Seq Tube sa reservoir #10 na may label na "I-load ang Library Dito".
- I-slide ang bagong reagent cartridge sa reagent compartment at isara ang pinto ng reagent compartment.
- Piliin ang I-load at maghintay ng ~30 segundo hanggang lumitaw ang reagent cartridge ID sa screen at ang mga sensor ay naka-check sa berde.
- Mula sa drop-down na listahan ng Recipe, piliin ang [Custom] “Olink_NSQ550_HighOutput_V1” na opsyon sa recipe.
- Piliin ang Susunod.
Simulan ang sequencing run
- Kumpirmahin ang mga run parameter na ipinapakita sa Review screen. Upang i-edit ang anumang mga parameter, pindutin ang Bumalik upang bumalik sa screen ng Run Setup.
- Piliin ang Susunod. Ang pagtakbo ay magsisimula pagkatapos ng isang awtomatikong pre-run check. Ang sequencing run time ay humigit-kumulang 7h30 min.
- Linisin ang lugar ng trabaho.
TANDAAN: Kapag nakumpleto na ang sequencing run, ang software ay magsisimula ng awtomatikong post-run wash gamit ang wash solution na ibinigay sa buffer cartridge at ang NaOCl na ibinigay sa reagent cartridge. Ang paghuhugas na ito ay tumatagal ng humigit-kumulang 90 minuto. Magiging aktibo ang Home button kapag nakumpleto na ang paghuhugas. Ang mga ginamit na cartridge at flow cell ay maaaring iwanang nasa lugar hanggang sa susunod na pagtakbo.
Subaybayan ang progreso ng pagpapatakbo
Gumagamit ang Olink ng NGS bilang readout upang mabilang ang dami ng isang kilalang sequence upang matantya ang konsentrasyon ng isang ibinigay na protina sa samples (kamag-anak sa iba pang mga samples). Ang kalidad ng data mula sa bawat Explore sequencing run ay pangunahing tinutukoy ng mga parameter ng QC na natatangi sa teknolohiya ng Olink. Samakatuwid, ang mga karaniwang sukatan ng kontrol sa kalidad na ginagamit sa kumbensyonal na NGS, gaya ng Q-score, ay hindi gaanong kritikal.
Kasaysayan ng rebisyon
| Bersyon | Petsa | Paglalarawan |
| 1.1 | 2021-12-13 | Mga pagbabago sa editoryal |
| 1.0 | 2021-12-01 | Bago |
www.olink.com
Para sa Gamit ng Pananaliksik Lamang. Hindi para sa Paggamit sa Diagnostic Procedures.
Kasama sa produktong ito ang lisensya para sa hindi pangkomersyal na paggamit ng mga produkto ng Olink. Maaaring mangailangan ng mga karagdagang lisensya ang mga komersyal na user. Mangyaring makipag-ugnayan sa Olink
Proteomics AB para sa mga detalye. Walang mga warranty, ipinahayag o ipinahiwatig, na lumalampas sa paglalarawang ito. Ang Olink Proteomics AB ay hindi mananagot para sa pinsala sa ari-arian, personal na pinsala, o pagkawala ng ekonomiya na dulot ng produktong ito.
Ang sumusunod na trademark ay pagmamay-ari ng Olink Proteomics AB: Olink®.
Ang produktong ito ay sakop ng ilang patent at patent application na available sa https://www.olink.com/patents/.
© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Ang lahat ng mga trademark ng third party ay pag-aari ng kani-kanilang mga may-ari. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Sweden
1192, v1.1, 2021-12-13
Mga Dokumento / Mga Mapagkukunan
 |
Olink Explore Sequencing gamit ang NextSeq 550 [pdf] User Manual I-explore ang Sequencing gamit ang NextSeq 550, Explore Sequencing, gamit ang NextSeq 550, NextSeq 550 |
