Olink Explore Sequencing באמצעות NextSeq 550

מָבוֹא

שימוש מיועד
Olink® Explore היא פלטפורמת בדיקות אימונו מרובות לגילוי סמנים ביולוגיים של חלבון אנושי. המוצר מיועד לשימוש מחקר בלבד, ולא לשימוש בהליכי אבחון. עבודת המעבדה תבוצע רק על ידי צוות מעבדה מיומן. עיבוד הנתונים יבוצע רק על ידי צוות מיומן. התוצאות נועדו לשמש את החוקרים בשילוב עם ממצאים קליניים או מעבדתיים אחרים.

לגבי מדריך זה
מדריך למשתמש זה מספק את ההוראות הדרושות לרצף Olink® Explore Libraries ב-Illumina® NextSeq™ 550. יש לעקוב אחר ההוראות באופן קפדני ומפורש. כל סטייה לאורך שלבי המעבדה עלולה לגרום לפגיעה בנתונים. לפני התחלת זרימת העבודה במעבדה, עיין ב-Olink® Explore Overview מדריך למשתמש להיכרות עם הפלטפורמה, כולל מידע על ריאגנטים, ציוד ותיעוד הדרוש, סוףview של זרימת העבודה, כמו גם הנחיות מעבדה. להוראות כיצד להפעיל את ערכות הריאגנטים של Olink® Explore, עיין במדריך למשתמש הרלוונטי של Olink® Explore. לעיבוד נתונים וניתוח של תוצאות רצף Olink® Explore, עיין במדריך למשתמש של Olink® MyData Cloud. כל הסימנים המסחריים וזכויות היוצרים הכלולים בחומר זה הם קניינה של Olink® Proteomics AB, אלא אם צוין אחרת.

תמיכה טכנית
לתמיכה טכנית, צור קשר עם Olink Proteomics בכתובת support@olink.com.

הוראות מעבדה

פרק זה מספק הוראות כיצד לרצף ספריות Olink ב-NextSeq™ 550 באמצעות ערכת NextSeq™ 500/550 High Output v2.5 (75 מחזורים). הפרוטוקול המשמש לרצף הוא התאמה של זרימת העבודה הסטנדרטית של Illumina® NGS עבור Illumina® NextSeq™ 550. לפני שתמשיך לרצף, ודא שאיכות הספרייה המטוהרת אומתה. עיין במדריך למשתמש הרלוונטי של Olink Explore לקבלת הוראות לגבי בקרת איכות.

תכנן את ריצת הרצף
ניתן לרצף ספריית Olink אחת לכל תא זרימה של NextSeq™ 550 High Output ולכל הפעלה. מספר תאי הזרימה וההפעלות הגבוהות הנדרשות לרצף ערכות הריאגנטים השונות של Olink Explore מתואר בטבלה 1. אם נדרשת יותר מהפעלה אחת, חזור על ההוראות המתוארות במדריך זה.

טבלה 1. תכנון ריצה ברצף:

Olink® Explore Reagent Kit	מספר ספריות Olink	מספר תאי/ות זרימה וריצות
Olink® Explore 384 Reagent Kit	1	1
ערכת ריאגנטים של Olink® Explore 4 x 384	4	4
Olink® Explore 1536 Reagent Kit	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 3072 Reagent Kit	8	8

התקן מתכון מותאם אישית של Olink®
במהלך שלב זה, המתכון המותאם אישית של Olink® מותקן ב-NextSeq™ 550. שלב זה צריך להתבצע פעם אחת בלבד, לפני ביצוע ריצת רצף Olink בפעם הראשונה.
פֶּתֶק: המתכון המותאם אישית של Olink יעבוד רק עם ערכות NextSeq™ 500/550 High Output ו- NextSeq™ Control Software 4.0

1. פתח את הדחיסה והצב את המתכון המותאם אישית Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 בתיקייה הבאה של מכשיר NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
2. תחת התאמה אישית של מערכת > ניהול מכשיר, הפעל מתכונים מותאמים אישית. אם לא נבחרה, אפשרות המתכון המותאם אישית לא תופיע במהלך הגדרת ההפעלה.

פֶּתֶק: בגרסת התוכנה NCS 4.0, האפשרות לבחור מתכון מותאם אישית תתרחש רק לאחר טעינת מחסנית המגיב, לא בדף ההגדרה הקודם.
פֶּתֶק: יש להגדיר את הריצה במצב ידני כדי לאפשר מתכונים מותאמים אישית.

הכן ריאגנטים לרצף

במהלך שלב זה, מחסנית המגיב המכילה ריאגנטים מקבץ ורצף מופשרת ותא הזרימה מוכן.

הכן מחסנית מגיב
אַזהָרָה: מחסנית המגיב מכילה כימיקלים שעלולים להיות מסוכנים. ללבוש ציוד מגן הולם ולהשליך ריאגנטים משומשים בהתאם לתקנים החלים. למידע נוסף, עיין במדריך המערכת של Illumina NextSeq 550 (מסמך מס' 15069765).

הכן ספסל

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2 (75 מחזורים).

הוראות

1. הנח את מחסנית המגיב הקפואה שקועה למחצה במים ממוזגים בחדר ותנו לה להפשיר למשך שעה. ודא שכל מאגרי הריאגנטים של המחסניות מופשרים לחלוטין.
   פֶּתֶק: מטעמי נוחות, הפשר את המחסנית יום קודם ואחסן אותה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. בטמפרטורה זו, הריאגנטים יציבים עד שבוע אחד.
2. יבש את בסיס המחסנית ביסודיות עם מגבת נייר וספג את אטמי נייר הכסף יבש עם טישו ללא מוך במידת הצורך.
3. הפוך את המחסנית עשר פעמים כדי לערבב היטב את הריאגנטים המופשרים בתוכם.
4. הקש בעדינות את המחסנית על הספסל כדי להסיר בועות אוויר. אחסן את המחסנית בטמפרטורת החדר אם היא תשמש תוך 4 שעות.

הכן תא זרימה

הכן ספסל

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5.

הוראות

1.  הביאו את תא הזרימה הקירור לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
2.  לבש כפפות חדשות ללא אבקה (כדי למנוע זיהום משטח הזכוכית של תא הזרימה).
3.  כשתהיה מוכן לטעון את תא הזרימה לתוך המכשיר, הסר את תא הזרימה מהאריזה ואת צדפת הפלסטיק.
4.  בדוק את תא הזרימה. אם חלקיקים או אבק נראים על כל אחד ממשטחי הזכוכית, נקה את המשטח הרלוונטי עם מגבון איזופרופיל אלכוהול נטול מוך וייבש אותו עם רקמת מעבדה בעלת מוך נמוך.

הכן את ספריית Olink® לרצף

במהלך שלב זה מכינים דילולים של NaOH ו-Tris-HCl, וספריית Olink המטוהרת והמבוקרת מדוללת ומופנת בשלבים עוקבים.

הכן דילול NaOH
דילול ה-NaOH משמש לדנטורציה של הספריות.

הכן ספסל

• מלאי 1 N NaOH
• מים MilliQ
• 1x צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)
• פיפטה ידנית (10-100 μL)
• סנן קצות פיפטה

לפני שמתחילים
סמן את צינור המיקרוצנטריפוגה "NaOH".

הוראות

1. הכן דילול של 0.2 N NaOH בצינור NaOH לפי טבלה 2.
2. מערבבים את צינור ה-NaOH ביסודיות וסובב למטה. השתמש תוך 12 שעות.

טבלה 2. דילול 0.2 N NaOH

מֵגִיב	נפח (μL)
מים MilliQ	80
מלאי 1 N NaOH	20

2.4.2 הכן דילול Tris-HCl
דילול Tris-HCl משמש לנטרול הספרייה הדנטורטית.

הכן ספסל

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 ציר (תמיסת Trizma® hydrochloride)
• מים MilliQ
• 1x צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)
• פיפטה ידנית (10-100 μL)
• סנן קצות פיפטה

לפני שמתחילים

• סמן את צינור המיקרו-צנטריפוגה "Tris-HCl"

הוראות

1. הכן דילול של 200 מ"מ Tris-HCl בצינור Tris-HCl לפי טבלה 3.
2. מערבלים את צינור ה-Tris-HCl ביסודיות וסובבו אותו למטה.

טבלה 3. דילול 200 מ"מ Tris-HCl:

מֵגִיב	נפח (μL)
מים MilliQ	80
1M Tris-HCl pH 7.0 ציר (תמיסת Trizma® hydrochloride)	20

דילול ספריות Olink®
במהלך שלב זה, ספריית Olink המטוהרת והמבוקרת באיכות מדולל 1:33.

הכן ספסל

• Lib Tube, הוכן לפי מדריך המשתמש הרלוונטי של Olink Explore
• מים MilliQ
• 1x צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל)
• פיפטות ידניות (0.5-10 ו-100-1000 μL)
• סנן קצות פיפטה

לפני שמתחילים

• הפשירו את ה-Lib Tube אם קפוא.
• סמן את שפופרת המיקרוצנטריפוגה החדשה: "Dil".

הוראות

1. הוסף 96 μL של מים MilliQ לצינור Dil.
2. מערבלים את ה-Lib Tube וסובב אותו לזמן קצר.
3. העבירו 3 μL מה-Lib Tube ל-Dil Tube.
4. מערבלים את צינור הדיל וסובבו אותו לזמן קצר

דנטור ודלל את Olink® Library לריכוז הטעינה הסופי
במהלך שלב זה, ספריית Olink המדוללת עוברת דנטורציה ומדוללת עוד יותר לריכוז הטעינה הסופי.

הכן ספסל

• צינור דיל, שהוכן בשלב הקודם
• דילול 0.2 N NaOH, מוכן טרי בשלב הקודם
• דילול 200 מ"מ Tris-HCl (pH 7.0), שהוכן בשלב הקודם
• חיץ הכלאה 1 (HT1) כלול ב- NextSeq™ Accessory Box v2
• 2 צינורות מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל ו-2 מ"ל)
• פיפטות ידניות (0.5-10 ו-100-1000 μL)
• סנן קצות פיפטה

לפני שמתחילים

• הפשר את חיץ HT1 הקפוא בטמפרטורת החדר. יש לאחסן ב-+4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
• סמן את צינור המיקרוצנטריפוגה החדש בנפח 1.5 מ"ל: "Den" (עבור הספרייה הדנטורטית).
• סמן את שפופרת המיקרוצנטריפוגה החדשה בנפח 2 מ"ל: "Seq" (עבור הספרייה המוכנה לטעינה).

הוראות

1. העבר 5 μL מצינור הדיל לצינור ה-Den.
2. הוסף 5 μL של 0.2 N NaOH ל-Den Tube.
3. מערבלים את ה-Den Tube וסובב אותו לזמן קצר.
4. דגירה של ה-Den Tube במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי לסנן את הספרייה.
5. הוסף 5 μL של 200 מ"מ Tris-HCl (pH 7.0) ל-Den Tube כדי לנטרל את התגובה.
6. מערבלים את ה-Den Tube וסובב אותו לזמן קצר.
7. הוסף 985 μL של HT1 מצונן מראש ל-Den Tube.
8. מערבלים את ה-Den Tube וסובב אותו לזמן קצר. ניתן לאחסן את הצינור ב-+4 מעלות צלזיוס עד לשימוש (באותו יום).
9. העבר 205 μL מצינור ה-Den לצינור Seq.
10. הוסף 1095 μL של HT1 מצונן מראש לצינור Seq.
11. הפוך את ה-Seq Tube כדי לערבב את הריאגנטים וסובב אותו לזמן קצר. נפח הטעינה הסופי הוא 1.3 מ"ל.
12. המשך מיד ל-2.5 בצע ריצת רצף Olink®.

בצע ריצת רצף Olink®

במהלך שלב זה, מחסנית המאגר, תא הזרימה ומחסנית המגיב המוכנה המכילה את ספריית Olink נטענים לתוך NextSeq 550, והרצת הרצף מתחילה באמצעות המתכון המותאם אישית של Olink.

הכן ספסל

• Seq Tube (עם ספרייה מוכנה לטעינה), הוכנה בשלב הקודם
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, הוכנה בשלב הקודם
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, הוכן בשלב הקודם
• 1x NextSeq™ 500/550 Buffer Cartridge v2 (75 מחזורים), בטמפרטורת החדר

הגדר פרמטרים של ריצת רצף
במהלך שלב זה, נבחרים פרמטרים של ריצת רצף ב-NextSeq™ 550.

1. במסך הבית של NextSeq™ 550, בחר ניסוי.
2. במסך Select Assay, בחר רצף.
3. בדף הגדרת הפעלה, בחר מצב ריצה ידנית ולאחר מכן הבא.
4. הגדר את פרמטרי הריצה באופן הבא:
   • בשדה שם הפעלה, הזן מזהה ניסוי ייחודי.
   • בשדה מזהה ספרייה, הזן את מזהה הספרייה שאתה מפעיל (אופציונלי).
   • בשדה קריאה סוג, בחר באפשרות קריאה בודדת.
   • הזן את מספר המחזורים באופן הבא:
     • קראו 1:24
     • אינדקס 1: 0
     • אינדקס 2: 0
     • קראו 2:0
   • השאר את תיבת הסימון עבור פריימרים מותאמים אישית לא מסומנת.
   • הגדר את מיקום תיקיית הפלט עבור הנתונים הגולמיים של הריצה הנוכחיים. בחר עיון כדי לשנות את מיקום תיקיית הפלט.
5. אל תגדיר Sample Sheet.
6. בחר ניקוי חומרים מתכלים עבור הפעלה זו.
7. בחר הבא.

טען תא זרימה לתוך NextSeq™ 550

1. הסר את תא הזרימה בשימוש מהריצה הקודמת.
2. הנח את תא הזרימה המוכן החדש על ה-stage.
3. בחר טען. הדלת נסגרת אוטומטית.
4. כאשר מזהה תא הזרימה מופיע על המסך והחיישנים מסומנים בירוק, בחר הבא

רוקן את מיכל הריאגנט
אַזהָרָה: סט ריאגנטים זה מכיל כימיקלים שעלולים להיות מסוכנים. ללבוש ציוד מגן הולם ולהשליך ריאגנטים משומשים בהתאם לתקנים החלים. למידע נוסף, עיין במדריך המערכת של Illumina NextSeq 550.

1. פתח את הדלת של תא המאגר, הסר את מיכל הריאגנטים המושקעים מהתא התחתון והשליך את התוכן בהתאם לתקנים החלים.
2. החלק את מיכל הריאגנט הריק בחזרה לתוך תא המאגר התחתון. לחיצה נשמעת מציינת שהמכל ממוקם נכון.

טען מחסנית חיץ

1. הסר את מחסנית המאגר המשומשת מתא המאגר העליון והשליך את התוכן בהתאם לתקנים החלים.
2. החלק מחסנית חיץ חדשה לתוך תא המאגר העליון. לחיצה נשמעת מציינת שהמחסנית ממוקמת כהלכה. ודא שמזהה מחסנית המאגר מופיע על המסך ושהחיישנים מסומנים בירוק.
3. סגור את הדלת של תא המאגר ובחר הבא.

טען מחסנית מגיב

1. פתח את הדלת של תא הגיב, הסר את מחסנית המגיב המשומשת והשליך את התוכן שאינו בשימוש בהתאם לתקנים החלים. המאגר בעמדה 6 ניתן להסרה כדי להקל על סילוק בטוח.
2. נקב את החותם של המאגר מס' 10 שכותרתו "טען ספרייה כאן" עם קצה פיפטה נקי של 1 מ"ל.
3. טען 1.3 מ"ל את ספריית Olink מ-Seq Tube למאגר מס' 10 שכותרתו "טען ספרייה כאן".
4. החלק את מחסנית הגיב החדשה לתוך תא הגיב וסגור את דלת תא הגיב.
5. בחר טען והמתן כ-30 שניות עד שמזהה מחסנית המגיב יופיע על המסך והחיישנים מסומנים בירוק.
6. מהרשימה הנפתחת מתכון, בחר באפשרות המתכון [מותאם אישית] "Olink_NSQ550_HighOutput_V1".
7. בחר הבא.

התחל ריצת רצף

1. אשר את פרמטרי הריצה המוצגים ב-Review מָסָך. כדי לערוך פרמטרים כלשהם, הקש Back כדי לחזור למסך הפעל הגדרות.
2. בחר הבא. הריצה מתחילה לאחר בדיקה אוטומטית לפני הריצה. זמן הריצה ברצף הוא בערך 7h30 דקות.
3. נקה את אזור העבודה.

פֶּתֶק: כאשר הפעלת הרצף מסתיימת, התוכנה יוזמת שטיפה אוטומטית לאחר הריצה באמצעות פתרונות הכביסה הניתנים במחסנית המאגר וה-NaOCl המסופק במחסנית המגיב. כביסה זו אורכת כ-90 דקות. כפתור הבית הופך לפעיל לאחר השלמת הכביסה. ניתן להשאיר מחסניות משומשות ותא זרימה במקומם עד להפעלה הבאה.

מעקב אחר התקדמות הריצה
Olink משתמש ב-NGS כקריאה כדי לכמת את הכמות של רצף ידוע על מנת להעריך את הריכוז של חלבון נתון ב-samples (ביחס לסעיפים אחריםamples). איכות הנתונים מכל ריצת רצף Explore נקבעת בעיקר על ידי פרמטרי QC הייחודיים לטכנולוגיית Olink. לפיכך, מדדי בקרת איכות סטנדרטיים המשמשים ב-NGS קונבנציונאלי, כגון Q-score, פחות קריטיים.

היסטוריית גרסאות

גִרְסָה	תַאֲרִיך	תֵאוּר
1.1	2021-12-13	שינויים בעריכה
1.0	2021-12-01	חָדָשׁ

www.olink.com
לשימוש מחקר בלבד. לא לשימוש בהליכי אבחון.
מוצר זה כולל רישיון לשימוש לא מסחרי במוצרי Olink. משתמשים מסחריים עשויים לדרוש רישיונות נוספים. נא לפנות לאולינק
Proteomics AB לפרטים. אין אחריות, מפורשת או משתמעת, החורגת מעבר לתיאור זה. Olink Proteomics AB אינה אחראית לנזק לרכוש, פציעה אישית או הפסד כלכלי שנגרם על ידי מוצר זה.
הסימן המסחרי הבא נמצא בבעלות Olink Proteomics AB: Olink®.
מוצר זה מכוסה במספר פטנטים ובקשות לפטנטים הזמינים ב https://www.olink.com/patents/.
© זכויות יוצרים 2021 Olink Proteomics AB. כל הסימנים המסחריים של צד שלישי הם רכושם של בעליהם בהתאמה. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Sweden
1192, v1.1, 2021-12-13

מסמכים / משאבים

Olink Explore Sequencing באמצעות NextSeq 550 [pdfמדריך למשתמש חקור רצף באמצעות NextSeq 550, חקור רצף, באמצעות NextSeq 550, NextSeq 550

הפניות

• מדריך למשתמש