Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

Napomena o dokumentu
Korisnički priručnik Olink® Explore, dokument br. 1153, je zastario i zamijenjen je sljedećim dokumentima:

• Olink® Explore Overview Priručnik za upotrebu, dok. br. 1187
• Priručnik za korisnike Olink® Explore 384, dokument br. 1188
• Priručnik za upotrebu Olink® Explore 4 x 384, dokument br. 1189
• Olink® Explore 1536 & Expansion korisnički priručnik, dokument br. 1190
• Priručnik za korisnike Olink® Explore 3072, dokument br. 1191
• Olink® Explore Sequencing koristeći NextSeq 550 korisnički priručnik, dok. br. 1192
• Olink® Explore Sequencing koristeći NextSeq 2000 korisnički priručnik, dok. br. 1193
• Olink® Explore Sequencing koristeći NovaSeq 6000 korisnički priručnik, dok. br. 1194

Uvod

Namjena
Olink® Explore je multipleksna platforma za imunotestiranje za otkrivanje biomarkera humanih proteina. Proizvod je namijenjen samo za istraživačku upotrebu, a ne za upotrebu u dijagnostičkim procedurama. Laboratorijski rad će voditi samo obučeno laboratorijsko osoblje. Obradu podataka vrši samo obučeno osoblje. Rezultati su namijenjeni da ih istraživači koriste u kombinaciji s drugim kliničkim ili laboratorijskim nalazima.
O ovom priručniku
Ovaj korisnički priručnik pruža uputstva potrebna za sekvencioniranje Olink® Explore biblioteka na Illumina® NextSeq™ 2000. Uputstva se moraju striktno i eksplicitno slijediti. Bilo kakva odstupanja u laboratorijskim koracima mogu dovesti do umanjenih podataka. Prije pokretanja laboratorijskog toka rada, konsultujte Olink® Explore Overview Korisnički priručnik za uvod u platformu, uključujući informacije o reagensima, opremi i potrebnoj dokumentaciji, prekoview toka rada, kao i laboratorijske smjernice. Za uputstva o tome kako da pokrenete Olink® Explore komplete reagensa, pogledajte odgovarajući Olink® Explore korisnički priručnik. Za obradu podataka i analizu rezultata sekvence Olink® Explore, pogledajte korisnički priručnik za Olink® NPX Explore. Svi zaštitni znakovi i autorska prava sadržana u ovom materijalu vlasništvo su Olink® Proteomics AB, osim ako nije drugačije navedeno.
Tehnička podrška
Za tehničku podršku kontaktirajte Olink Proteomics na support@olink.com.

Laboratorijske upute

Ovo poglavlje pruža upute o tome kako sekvencirati Olink biblioteke na NextSeq™ 2000 pomoću NextSeq™ 1000/2000 P2 reagensa (100 ciklusa) v3. Protokol koji se koristi za sekvenciranje je adaptacija Illumina® standardnog NGS radnog toka za Illumina® NextSeq™ 2000.
Prije nego što nastavite s sekvenciranjem, provjerite je li provjerena kvaliteta pročišćene Olink biblioteke. Pogledajte primjenjivi korisnički priručnik Olink Explore za upute o kontroli kvaliteta.
Planirajte sekvenciranje
Jedna Olink biblioteka može biti sekvencionirana po NextSeq™ 2000 P2 protočnoj ćeliji i po pokretanju. Broj P2 protočnih ćelija i ciklusa potrebnih za sekvenciranje različitih kompleta reagensa Olink Explore opisan je u Tabeli 1.
Ako je potrebno više od jednog pokretanja, ponovite upute opisane u ovom priručniku.
Tabela 1. Planiranje sekvenciranja

Olink® Explore komplet reagensa	Broj Olink biblioteka	Broj protočnih ćelija i ciklusa
Komplet reagensa Olink® Explore 384	1	1
Olink® Explore 4 x 384 komplet reagensa	4	4
Komplet reagensa Olink® Explore 1536	4	4
Olink® Explore komplet reagensa za proširenje	4	4
Komplet reagensa Olink® Explore 3072	8	8

Pripremite Olink® prilagođeni recept
Tokom ovog koraka, Olink® prilagođeni recept se priprema na NextSeq™ 2000. Ovaj korak treba izvesti samo jednom, prije nego što se Olink sekvenciranje izvede po prvi put.
Raspakujte i sačuvajte Olink prilagođeni recept XML-file Olink_NSQ2K_P2_V1 u odgovarajućoj fascikli instrumenta.
NAPOMENA: Olink prilagođeni recept će raditi samo sa NextSeq™ 1000/2000 P2 reagensima (100 ciklusa) v3 kompletom i NextSeq™ 1000/2000 kontrolnim softverom v1.2 ili v1.4.

Pripremite reagense za sekvenciranje
Tokom ovog koraka, uložak za reagens koji sadrži reagense za grupisanje i sekvenciranje se odmrzava i priprema se protočna ćelija.

UPOZORENJE: Kartridž za reagens sadrži potencijalno opasne hemikalije. Nosite adekvatnu zaštitnu opremu i bacite upotrijebljene reagense u skladu sa važećim standardima. Za više informacija pogledajte Sistemski vodič za Illumina NextSeq 1000 i 2000 (dokument #1000000109376).

Pripremite kertridž za reagens
Odmrzavanje neotvorenog uloška može se obaviti na tri različite metode: na sobnoj temperaturi, u kontrolisanoj vodenoj kupelji ili u frižideru.

Pripremite klupu

• 1x NextSeq™ 1000/2000 P2 kartridž s reagensom (100 ciklusa)

Uputstva
Odmrznite kertridž sa reagensom kao što je opisano u tabeli 2.
Tabela 2. Metode odmrzavanja kertridža za reagens

Metoda odmrzavanja	Uputstva
Na sobnoj temperaturi	• Bez otvaranja vrećice od srebrne folije, stavite zamrznuti uložak s reagensom na sto i odmrznite ga na sobnoj temperaturi 9 sati. Ne prelazi 16 sati. • Uverite se da je etiketa na vrećici okrenuta nagore i da vazduh može da cirkuliše oko kertridža.
U vodenom kupatilu	• Bez otvaranja vrećice od srebrne folije, stavite zamrznuti uložak s reagensom napola potopljen u kontrolirano vodeno kupatilo na 25 °C i ostavite da se odmrzne 6 sati. Ne prelazi 8 sati. • Uverite se da je etiketa na vrećici okrenuta nagore i da se kertridž ne preokrene tokom odmrzavanja. • Patronu dobro osušite papirnim ubrusom.
U frižideru	• Bez otvaranja vrećice od srebrne folije, stavite kartušu na sto i odmrznite je na sobnoj temperaturi 6 sati. • Uverite se da je etiketa na vrećici okrenuta nagore i da vazduh može da cirkuliše oko kertridža. • Završite odmrzavanje kertridža u frižideru na 12 sati. Ne prelazi 72 sata. • Prije pokretanja, izvadite odmrznuti neotvoreni uložak iz frižidera i ostavite ga da dostigne sobnu temperaturu najmanje 15 minuta, ali ne više od 1 sat.

NAPOMENA: Odmrznuti patroni se ne mogu ponovo zamrznuti i moraju se čuvati na 4 °C, maksimalno 72 sata.

Pripremite protočnu ćeliju. Pripremite klupu

• 1x NextSeq™ 1000/2000 P2 protočna ćelija

Uputstva

1. Ohlađenu protočnu ćeliju staviti na sobnu temperaturu 10-15 minuta.

Pripremite Olink® biblioteku za sekvenciranje

Tokom ovog koraka, pročišćena i kontrolirana kvaliteta Olink biblioteka se razrjeđuje do konačne koncentracije punjenja. Imajte na umu da se denaturacija biblioteke vrši automatski na instrumentu.
Pripremite klupu

• Lib Tube, pripremljena u skladu sa važećim korisničkim priručnikom Olink Explore
• 1x RSB sa Tween 20
• MilliQ voda
• 2x epruvete za mikrocentrifugu (1.5 mL)
• Ručna pipeta (10, 100 i 1000 μL)
• Vrhovi za filter pipete

Prije nego počnete

• Odmrznite Lib Tube ako je zamrznuta.
• Odmrznite zamrznuti RSB sa Tween 20 na sobnoj temperaturi 10 minuta. Čuvati na +4 °C do upotrebe.
• Označite dvije nove epruvete za mikrocentrifugu od 1.5 mL na sljedeći način:
  • Označite jednu epruvetu “Dil” (za 1:100 razrijeđenu biblioteku)
  • Označite jednu epruvetu “Seq” (za biblioteku spremnu za punjenje)

Uputstva

1. Dodajte 495 μL MilliQ vode u Dil epruvetu.
2. Vortex the Lib Tube i nakratko je zavrtite.
3. Ručno prenesite 5 μL iz Lib epruvete u Dil epruvetu.
4. Zavrtite Dil Tube i nakratko je zavrtite.
5. Dodajte 20 μL RBS-a sa Tween 20 u Seq epruvetu.
6. Ručno prenesite 20 μL iz Dil epruvete u Seq epruvetu.
7. Zavrtite cev Seq i nakratko je zavrtite.
8. Odmah nastavite na 2.5 Ubacite protočnu ćeliju i Olink® biblioteku u kertridž za reagens. NAPOMENA: Čuvajte Lib Tube na -20 °C u slučaju potencijalnog ponovnog pokretanja.

Ubacite protočnu ćeliju i Olink® biblioteku u kertridž za reagens
Tokom ovog koraka, protočna ćelija i razrijeđena Olink biblioteka se stavljaju u uložak za odmrznuti reagens.
Pripremite klupu

• 1x odmrznuti NextSeq™ 1000/2000 P2 uložak s reagensom (100 ciklusa), pripremljen u prethodnom koraku
• 1x NextSeq™ 1000/2000 P2 protočna ćelija, pripremljena u prethodnom koraku
• Sex Tube (sa razrijeđenom Olink bibliotekom koja je spremna za punjenje), pripremljena u prethodnom koraku
• Ručna pipeta (100 μL)
• Vrh pipete (1 mL)

Pripremite kertridž

1. Izvadite uložak iz vrećice od srebrne folije.
2. Okrenite uložak deset puta da se odmrznuti reagensi dobro promešaju.

NAPOMENA: Normalno je čuti zveckanje unutrašnjih komponenti.

Ubacite protočnu ćeliju u kertridž

1. Kada ste spremni za punjenje protočne ćelije u uložak, uklonite protočnu ćeliju iz pakovanja. Držite protočnu ćeliju za sivi jezičak, s naljepnicom na jezičku okrenutom prema gore. Koristite nove rukavice bez pudera kako biste izbjegli kontaminaciju staklene površine protočne ćelije.
2. Umetnite protočnu ćeliju u otvor za protočnu ćeliju na prednjoj strani kertridža. Zvučni klik označava da je protočna ćelija pravilno postavljena.
3. Uklonite sivi jezičak tako što ćete ga izvući.

Ubacite Olink® biblioteku u kertridž

1. Probušite bibliotečki rezervoar čistim vrhom pipete od 1 mL.
2. Ubacite 20 μL Olink biblioteke iz Seq tube na dno rezervoara biblioteke.

Izvršite Olink® sekvenciranje
Tokom ovog koraka, Buffer kertridž sa učitanom protočnom ćelijom i Olink bibliotekom se učitava u NextSeq™ 2000, a sekvenciranje se pokreće pomoću Olink recepta.
Pripremite klupu

• 1x NextSeq™ 1000/2000 P2 kertridž sa reagensom (100 ciklusa) napunjen sa NextSeq™ 1000/2000 P2 protočnom ćelijom i razblaženom Olink bibliotekom, pripremljenom u prethodnom koraku.

Konfigurirajte način rada

1. U meniju kontrolnog softvera izaberite Postavke.
2. U okviru BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support, izaberite Local Run Setup.
3. Odaberite Samo proaktivna podrška kao dodatne postavke. Ova funkcija zahtijeva internetsku vezu.
4. Odaberite lokaciju hostinga za svoje podatke. Lokacija hostinga bi trebala biti u vašoj regiji ili blizu nje.
5. Postavite lokaciju izlazne mape za trenutne neobrađene podatke. Odaberite Odaberi za navigaciju i odaberite izlaznu mapu.
6. Označite potvrdni okvir Denature and Dilute On Board da automatski denaturirate i razrijedite biblioteku na instrumentu.
7. Potvrdite izbor u polju za potvrdu Purge Reagent Cartridge da biste automatski očistili neiskorištene reagense u pretinac za istrošene reagense u kertridžu.
8. Označite polje za potvrdu Automatska provjera ažuriranja softvera da biste automatski provjerili ažuriranja softvera (opcionalno). Ova funkcija zahtijeva internetsku vezu.
9. Odaberite Sačuvaj.

Postavite parametre pokretanja

NAPOMENA: Ovo uputstvo se odnosi na verziju 1.4 kontrolnog softvera NextSeq™ 1000/2000. Neki od dolje opisanih koraka mogu se razlikovati kada koristite verziju v1.2

1. U meniju upravljačkog softvera izaberite Start.
2. Odaberite Manually Set Up New Run i pritisnite Setup.
3. Na stranici Run Setup podesite parametre pokretanja na sljedeći način:

• U polje Naziv pokretanja unesite jedinstveni ID eksperimenta.
• Na padajućoj listi Vrsta čitanja izaberite opciju Pojedinačno čitanje.

Unesite broj ciklusa na sljedeći način:

• • Pročitaj 1: 24
  • Indeks 1: 0
  • Indeks 2: 0
  • Pročitaj 2: 0

NAPOMENA: Ključno je da Read 1 bude postavljeno na 24, inače će čitav niz propasti.
NAPOMENA: Zanemarite poruke upozorenja kada unosite broj ciklusa.

• Na padajućoj listi Custom Primer Wells izaberite No.
• U polju Prilagođeni recept (opcionalno) odaberite Odaberi za navigaciju i odaberite prilagođeni XML recept file Olink_NSQ2K_P2_V1. Odaberite Otvori.
• Nemojte uvoziti Sample Sheet.
• Provjerite je li lokacija izlazne mape ispravna. U suprotnom, odaberite Odaberi za navigaciju i odaberite željenu lokaciju izlazne mape.
• U polju Denature and Dilute Onboard, izaberite Enabled sa padajuće liste.
• Odaberite Prep.

Ubacite napunjeni kertridž

1. Odaberite Učitaj. Vizir instrumenta se otvara i ležište se izbacuje.
2. Stavite napunjenu kartušu na ležište sa naljepnicom okrenutom prema gore i protočnom ćelijom unutar instrumenta.
3. Odaberite Zatvori.
4. Nakon što je kertridž pravilno napunjen, provjerite parametre rada i odaberite Slijed. Instrument vrši provjere prije rada za instrument i fluide.
   NAPOMENA: Tokom provjere fluida, očekuje se da ćete čuti nekoliko pucketanja.
5. Uvjerite se da izvođenje počinje nakon što su automatske provjere prije pokretanja završene (~15 minuta). Trajanje sekvenciranja je približno 10h30 min.
   NAPOMENA: Za sve greške u provjeri prije pokretanja, pogledajte upute proizvođača.
   NAPOMENA: Pazite da ne udarite ili na drugi način ne ometate NextSeq™ 2000 tokom sekvenciranja. Instrument je osjetljiv na vibracije.
6. Očistite radno područje.

Pratite napredak pokretanja
Olink koristi NGS kao očitavanje za kvantificiranje količine poznate sekvence kako bi se procijenila koncentracija datog proteina u samples (u odnosu na druge samples). Kvalitet podataka iz svakog ciklusa Explore sekvenciranja uglavnom je određen QC parametrima jedinstvenim za Olink tehnologiju. Stoga su standardne metrike kontrole kvaliteta koje se koriste u konvencionalnim NGS, kao što je Q-score, manje kritične.
Izbacite i odbacite kertridž nakon rada

UPOZORENJE: Ovaj set reagensa sadrži potencijalno opasne hemikalije. Nosite adekvatnu zaštitnu opremu i bacite upotrijebljene reagense u skladu sa važećim standardima. Za više informacija pogledajte Sistemski vodič za Illumina NextSeq 1000 i 2000 (dokument #1000000109376).

1. Kada je izvođenje završeno, odaberite Eject Cartridge.
   NAPOMENA: Korišteni uložak uključujući protočnu ćeliju može se ostaviti na mjestu do sljedećeg rada, ali ne duže od 3 dana.
2. Izvadite kertridž iz ležišta.
3. Odložite reagense u skladu sa važećim standardima.
4. Odaberite Zatvori vrata. Ladica se ponovo puni.
5. Odaberite Početna za povratak na početni ekran.
   NAPOMENA: Pošto kertridž sadrži sve mehanizme za pokretanje sistema, kao i rezervoar za prikupljanje upotrebljenih reagensa, nema potrebe za pranjem instrumenta nakon rada.

Istorija revizija

Verzija	Datum	Opis
1.1	2022-11-01	1.2 Zamijenjen Olink® Mydata sa Olink® NPX Explore. 2.2 Edited.
1.0	2021-12-01	Novo

www.olink.com
Samo za istraživačku upotrebu. Nije za upotrebu u dijagnostičkim procedurama.
Ovaj proizvod uključuje licencu za nekomercijalnu upotrebu Olink proizvoda. Komercijalnim korisnicima mogu biti potrebne dodatne licence. Za detalje kontaktirajte Olink Proteomics AB. Ne postoje nikakve garancije, izričite ili implicirane, koje se protežu dalje od ovog opisa. Olink Proteomics AB nije odgovoran za imovinsku štetu, lične povrede ili ekonomski gubitak uzrokovan ovim proizvodom.

Sljedeći zaštitni znak je u vlasništvu Olink Proteomics AB: Olink®.
Ovaj proizvod je pokriven s nekoliko patenata i patentnih prijava dostupnih na https://www.olink.com/patents/.

© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Svi zaštitni znakovi trećih strana vlasništvo su njihovih vlasnika. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Švedska 1193, v1.1, 2022.

Dokumenti / Resursi

Olink NextSeq 2000 Explore Sequence [pdf] Korisnički priručnik NextSeq 2000 Explore Sequence, NextSeq 2000, Explore Sequence, Sequence

Reference

• Uputstvo za upotrebu