Olink Explore Sequencing duke përdorur NextSeq 550

Hyrje

Përdorimi i synuar
Olink® Explore është një platformë e imuno-analizimit të shumëfishtë për zbulimin e biomarkerëve të proteinave njerëzore. Produkti është menduar vetëm për përdorim kërkimor dhe jo për përdorim në procedurat diagnostike. Puna laboratorike do të drejtohet vetëm nga personeli i trajnuar i laboratorit. Përpunimi i të dhënave do të kryhet vetëm nga staf i trajnuar. Rezultatet janë menduar të përdoren nga studiuesit në lidhje me gjetjet e tjera klinike ose laboratorike.

Rreth këtij manuali
Ky manual përdorimi ofron udhëzimet e nevojshme për të renditur bibliotekat Olink® Explore në Illumina® NextSeq™ 550. Udhëzimet duhet të ndiqen rreptësisht dhe në mënyrë eksplicite. Çdo devijim përgjatë hapave laboratorikë mund të rezultojë në të dhëna të dëmtuara. Përpara se të filloni rrjedhën e punës laboratorike, konsultohuni me Olink® Explore Overview Manuali i përdoruesit për një hyrje në platformë, duke përfshirë informacionin rreth reagentëve, pajisjet dhe dokumentacionin e nevojshëm, një mbiview të rrjedhës së punës, si dhe udhëzimet laboratorike. Për udhëzime se si të përdorni paketat e reagentëve Olink® Explore, referojuni manualit të përdorimit të Olink® Explore. Për përpunimin e të dhënave dhe analizën e rezultateve të sekuencës Olink® Explore, referojuni Udhëzuesit të Përdoruesit të Olink® MyData Cloud. Të gjitha markat tregtare dhe të drejtat e autorit të përfshira në këtë material janë pronë e Olink® Proteomics AB, përveç rasteve kur përcaktohet ndryshe.

Mbështetje teknike
Për mbështetje teknike, kontaktoni Olink Proteomics në support@olink.com.

Udhëzime laboratorike

Ky kapitull ofron udhëzime se si të renditni bibliotekat Olink në NextSeq™ 550 duke përdorur Kompletin e Prodhimit të Lartë NextSeq™ 500/550 v2.5 (75 cikle). Protokolli i përdorur për renditjen është një përshtatje e rrjedhës së punës standarde të Illumina® NGS për Illumina® NextSeq™ 550. Përpara se të vazhdoni me renditjen, sigurohuni që cilësia e Bibliotekës së pastruar të jetë verifikuar. Referojuni manualit të përdorimit të Olink Explore për udhëzime rreth kontrollit të cilësisë.

Planifikoni ekzekutimin e renditjes
Një Bibliotekë Olink mund të renditet për çdo qelizë të rrjedhës së daljes së lartë NextSeq™ 550 dhe për ekzekutim. Numri i qelizave të rrjedhës së daljes së lartë dhe ekzekutimeve të kërkuara për të renditur grupet e ndryshme të reagentëve Olink Explore përshkruhet në Tabelën 1. Nëse kërkohet më shumë se një ekzekutim, përsëritni udhëzimet e përshkruara në këtë manual.

Tabela 1. Planifikimi i ekzekutimit të renditjes:

Instaloni recetën e personalizuar të Olink®
Gjatë këtij hapi, receta e personalizuar Olink® instalohet në NextSeq™ 550. Ky hap duhet të kryhet vetëm një herë, përpara se të kryhet për herë të parë një ekzekutim i renditjes së Olink.
SHËNIM: Receta e personalizuar Olink do të funksionojë vetëm me kompletet e prodhimit të lartë NextSeq™ 500/550 dhe Softuerin e Kontrollit NextSeq™ 4.0

1. Shkëputni dhe vendosni recetën e personalizuar të Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 në dosjen e mëposhtme të instrumentit NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Software Control\Recipe\Custom\High\.
2. Nën Përshtatja e sistemit > Menaxho instrumentin, aktivizoni Recetat e personalizuara. Nëse nuk zgjidhet, opsioni i recetës me porosi nuk do të shfaqet gjatë konfigurimit të ekzekutimit.

SHËNIM: Në versionin e softuerit NCS 4.0, opsioni për të zgjedhur një recetë të personalizuar do të ndodhë vetëm pasi të jetë ngarkuar fisheku i reagentit, jo në faqen e mëparshme të konfigurimit.
SHËNIM: Ekzekutimi duhet të vendoset në modalitetin manual për të lejuar receta të personalizuara.

Përgatitni reagentët e sekuencës

Gjatë këtij hapi, fisheku i reagentit që përmban reagentët e grupimit dhe renditjes shkrihet dhe qeliza e rrjedhës përgatitet.

Përgatitni fishekun e reagentit
PARALAJMËRIM: Kutia e reagentit përmban kimikate potencialisht të rrezikshme. Vishni pajisje të përshtatshme mbrojtëse dhe hidhni reagentët e përdorur në përputhje me standardet në fuqi. Për më shumë informacion, referojuni Udhëzuesit të Sistemit Illumina NextSeq 550 (dokumenti #15069765).

Përgatitni stolin

• Fisheku i reagentit me dalje të lartë 1x NextSeq™ 500/550 v2 (75 cikle).

Udhëzimet

1. Vendoseni fishekun e ngrirë të reagentit gjysmë të zhytur në ujë të kalitur në dhomë dhe lëreni të shkrihet për 1 orë. Sigurohuni që të gjitha rezervuarët e reagentëve të fishekëve të jenë shkrirë plotësisht.
   SHËNIM: Për lehtësi, shkrini fishekun një ditë më parë dhe ruajeni gjatë natës në 4 °C. Në këtë temperaturë, reagentët janë të qëndrueshëm deri në një javë.
2. Thajeni plotësisht bazën e fishekut me një peshqir letre dhe fshijini vulat e letrës me një pecetë pa garzë nëse është e nevojshme.
3. Përmbysni fishekun dhjetë herë për të përzier plotësisht reagentët e shkrirë brenda.
4. Prekni fishekun butësisht në stol për të hequr flluskat e ajrit. Ruajeni fishekun në temperaturën e dhomës nëse do të përdoret brenda 4 orëve.

Përgatitni qelizën e rrjedhës

Përgatitni stolin

• 1x NextSeq™ 500/550 Qelizë me rrjedhje të lartë dalëse v2.5.

Udhëzimet

1.  Sillni qelizën e rrjedhjes në frigorifer në temperaturën e dhomës për 30 minuta.
2.  Vendosni doreza të reja pa pluhur (për të shmangur kontaminimin e sipërfaqes së qelqit të qelizës rrjedhëse).
3.  Kur të jeni gati për të ngarkuar qelizën e rrjedhës në instrument, hiqni qelizën e rrjedhës nga paketa dhe guaskën plastike.
4.  Inspektoni qelizën e rrjedhës. Nëse grimcat ose pluhuri janë të dukshme në ndonjë nga sipërfaqet e qelqit, pastroni sipërfaqen e aplikueshme me një pecetë me alkool izopropil pa garzë dhe thajeni me një pecetë laboratori me pak garzë.

Përgatitni Olink® Library për renditje

Gjatë këtij hapi, përgatiten hollimet e NaOH dhe Tris-HCl dhe biblioteka Olink e pastruar dhe e kontrolluar me cilësi hollohet dhe denatyrohet në hapa të njëpasnjëshëm.

Përgatitni hollimin e NaOH
Hollimi i NaOH përdoret për të denatyruar Bibliotekat.

Përgatitni stolin

• Stoku 1 N NaOH
• Ujë MilliQ
• 1 x tub mikrocentrifuge (1.5 mL)
• Pipetë manuale (10-100 μL)
• Majat e pipetës së filtrit

Para se të filloni
Shënoni tubin e mikrocentrifugës "NaOH".

Udhëzimet

1. Përgatitni një hollim 0.2 N NaOH në tubin NaOH sipas Tabelës 2.
2. Vidhosni plotësisht tubin NaOH dhe rrotullojeni poshtë. Përdoreni brenda 12 orëve.

Tabela 2. Hollimi 0.2 N NaOH

2.4.2 Përgatitja e hollimit Tris-HCl
Hollimi Tris-HCl përdoret për të neutralizuar Bibliotekën e denatyruar.

Përgatitni stolin

• 1 M Tris-HCl me pH 7.0 (tretësirë ​​hidroklorur Trizma®)
• Ujë MilliQ
• 1 x tub mikrocentrifuge (1.5 mL)
• Pipetë manuale (10-100 μL)
• Majat e pipetës së filtrit

Para se të filloni

• Shënoni tubin e mikrocentrifugës "Tris-HCl"

Udhëzimet

1. Përgatitni një hollim 200 mM Tris-HCl në tubin Tris-HCl sipas Tabelës 3.
2. Vidhosni tërësisht tubin Tris-HCl dhe rrotullojeni poshtë.

Tabela 3. Hollimi 200 mM Tris-HCl:

Holloni bibliotekat Olink®
Gjatë këtij hapi, Biblioteka Olink e pastruar dhe e kontrolluar me cilësi hollohet 1:33.

Përgatitni stolin

• Lib Tube, i përgatitur sipas manualit të përdorimit të Olink Explore
• Ujë MilliQ
• 1 x tub mikrocentrifuge (1.5 mL)
• Pipeta manuale (0.5-10 dhe 100-1000 μL)
• Majat e pipetës së filtrit

Para se të filloni

• Shkrini tubin Lib nëse është i ngrirë.
• Shënoni tubin e ri të mikrocentrifugës: "Dil".

Udhëzimet

1. Shtoni 96 μL ujë MilliQ në tubin Dil.
2. Përzieni tubin Lib dhe rrotullojeni për pak kohë.
3. Transferoni 3 μL nga Tubi Lib në Tubën Dil.
4. Vidhosni tubin Dil dhe rrotullojeni për pak kohë

Denatyrojeni dhe holloni Olink® Library deri në përqendrimin përfundimtar të ngarkimit
Gjatë këtij hapi, Biblioteka e holluar Olink denatyrohet dhe hollohet më tej deri në përqendrimin përfundimtar të ngarkimit.

Përgatitni stolin

• Dil Tube, i përgatitur në hapin e mëparshëm
• Hollim 0.2 N NaOH, i sapopërgatitur në hapin e mëparshëm
• Hollim 200 mM Tris-HCl (pH 7.0), i përgatitur në hapin e mëparshëm
• Buffer hibridizimi 1 (HT1) i përfshirë në kutinë shtesë të NextSeq™ v2
• 2 x tuba mikrocentrifuge (1.5 mL dhe 2 mL)
• Pipeta manuale (0.5-10 dhe 100-1000 μL)
• Majat e pipetës së filtrit

Para se të filloni

• Shkrini buferin HT1 të ngrirë në temperaturën e dhomës. Ruajeni në +4°C deri në përdorim.
• Shënoni tubin e ri të mikrocentrifugës 1.5 mL: "Den" (për Bibliotekën e denatyruar).
• Shënoni tubin e ri të mikrocentrifugës 2 mL: "Seq" (për Bibliotekën gati për ngarkim).

Udhëzimet

1. Transferoni 5 μL nga Dil Tube në Den Tube.
2. Shtoni 5 μL NaOH 0.2 N në tubin Den.
3. Vidhosni gypin e gërmimit dhe rrotullojeni për pak kohë.
4. Inkuboni Den Tube për 5 minuta në temperaturën e dhomës për të denatyruar Bibliotekën.
5. Shtoni 5 μL Tris-HCl 200 mM (pH 7.0) në Den Tube për të neutralizuar reaksionin.
6. Vidhosni gypin e gërmimit dhe rrotullojeni për pak kohë.
7. Shtoni 985 μL HT1 të ftohur paraprakisht në Den Tube.
8. Vidhosni tubin Den dhe rrotullojeni për pak kohë. Tubi mund të ruhet në +4 °C deri në përdorim (në të njëjtën ditë).
9. Transferoni 205 μL nga Tubi Den në Tubën Seq.
10. Shtoni 1095 μL HT1 të ftohur paraprakisht në tubin Seq.
11. Përmbysni tubin Seq për të përzier reagentët dhe rrotullojeni për pak kohë. Vëllimi përfundimtar i ngarkimit është 1.3 mL.
12. Vazhdoni menjëherë në 2.5 Kryeni ekzekutimin e sekuencës Olink®.

Kryeni ekzekutimin e sekuencës Olink®

Gjatë këtij hapi, fisheku i tamponit, qeliza e rrjedhës dhe fisheku i përgatitur i reagentit që përmban Bibliotekën Olink ngarkohen në NextSeq 550 dhe ekzekutimi i renditjes fillon duke përdorur recetën e personalizuar të Olink.

Përgatitni stolin

• Seq Tube (me Bibliotekë gati për t'u ngarkuar), përgatitur në hapin e mëparshëm
• Fisheku i reagentit 1x NextSeq™ 500/550 me dalje të lartë v2, i përgatitur në hapin e mëparshëm
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, përgatitur në hapin e mëparshëm
• Fisheku buffer 1x NextSeq™ 500/550 v2 (75 cikle), në temperaturë dhome

Konfiguro parametrat e ekzekutimit të sekuencës
Gjatë këtij hapi, parametrat e ekzekutimit të renditjes zgjidhen në NextSeq™ 550.

1. Në ekranin bazë të NextSeq™ 550, zgjidhni Eksperimento.
2. Në ekranin Select Assay, zgjidhni Sequence.
3. Në faqen Run Setup, zgjidhni Manual Run mode dhe më pas Next.
4. Vendosni parametrat e ekzekutimit si më poshtë:
   • Në fushën Run Name, vendosni një ID unike të eksperimentit.
   • Në fushën ID të Bibliotekës, shkruani ID-në e Bibliotekës që po përdorni (opsionale).
   • Në fushën Lexoni Lloji, zgjidhni opsionin Single Read.
   • Fusni numrin e cikleve si më poshtë:
     • Lexoni 1: 24
     • Indeksi 1: 0
     • Indeksi 2: 0
     • Lexoni 2: 0
   • Mbaje të pazgjedhur kutinë e zgjedhjes për abetaret e personalizuara.
   • Caktoni vendndodhjen e dosjes së daljes për të dhënat e papërpunuara të ekzekutimit aktual. Zgjidhni Shfleto për të ndryshuar vendndodhjen e dosjes së daljes.
5. Mos vendosni një Sample Fletë.
6. Zgjidhni Pastro materialet konsumuese për këtë ekzekutim.
7. Zgjidhni Tjetër.

Ngarko qelizën e rrjedhës në NextSeq™ 550

1. Hiqni qelizën e përdorur të rrjedhës nga ekzekutimi i mëparshëm.
2. Vendoseni qelizën e re të përgatitur të rrjedhës në stage.
3. Zgjidhni Ngarkoni. Dera mbyllet automatikisht.
4. Kur ID e qelizës së rrjedhës shfaqet në ekran dhe sensorët janë të kontrolluar në të gjelbër, zgjidhni Tjetër

Zbrazni enën e reagentit
PARALAJMËRIM: Ky grup reagentësh përmban kimikate potencialisht të rrezikshme. Vishni pajisje të përshtatshme mbrojtëse dhe hidhni reagentët e përdorur në përputhje me standardet në fuqi. Për më shumë informacion, referojuni Udhëzuesit të Sistemit Illumina NextSeq 550.

1. Hapni derën e ndarjes së tamponit, hiqni kutinë e reagentëve të shpenzuar nga ndarja e poshtme dhe hidhni përmbajtjen në përputhje me standardet në fuqi.
2. Rrëshqiteni përsëri enën e zbrazët të reagentit në ndarjen e poshtme të tamponit. Një klikim i dëgjueshëm tregon se kontejneri është vendosur saktë.

Ngarkoni fishekun e tamponit

1. Hiqni fishekun e përdorur të tamponit nga ndarja e sipërme e tamponit dhe hidhni përmbajtjen në përputhje me standardet në fuqi.
2. Rrëshqitni një fishek të ri tampon në ndarjen e sipërme të tamponit. Një klikim i dëgjueshëm tregon që fisheku është vendosur saktë. Sigurohuni që ID e fishekut të tamponit të shfaqet në ekran dhe që sensorët të jenë kontrolluar me ngjyrë të gjelbër.
3. Mbyllni derën e ndarjes së tamponit dhe zgjidhni Next.

Ngarkoni fishekun e reagentit

1. Hapni derën e ndarjes së reagentit, hiqni fishekun e përdorur të reagentit dhe hidhni përmbajtjen e papërdorur në përputhje me standardet në fuqi. Rezervuari në pozicionin 6 është i lëvizshëm për të lehtësuar asgjësimin e sigurt.
2. Shponi vulën e rezervuarit #10 të etiketuar si "Load Library Here" me një majë pipete të pastër 1 mL.
3. Ngarkoni 1.3 mL Bibliotekën Olink nga Tubi Seq në rezervuarin #10 të etiketuar si "Ngarko Bibliotekën Këtu".
4. Rrëshqitni fishekun e ri të reagentit në ndarjen e reagentit dhe mbyllni derën e ndarjes së reagentit.
5. Zgjidhni Load dhe prisni për ~30 sekonda derisa ID e fishekut të reagentit të shfaqet në ekran dhe sensorët të kontrollohen me ngjyrë të gjelbër.
6. Nga lista rënëse Receta, zgjidhni opsionin e recetës [Custom] “Olink_NSQ550_HighOutput_V1”.
7. Zgjidhni Tjetër.

Filloni ekzekutimin e renditjes

1. Konfirmoni parametrat e ekzekutimit të shfaqur në Review ekran. Për të modifikuar ndonjë parametër, shtypni Back për t'u kthyer në ekranin Run Setup.
2. Zgjidhni Tjetër. Vrapimi fillon pas një kontrolli automatik para ekzekutimit. Koha e ekzekutimit të renditjes është afërsisht 7h30 min.
3. Pastroni zonën e punës.

SHËNIM: Kur ekzekutimi i renditjes përfundon, softueri fillon një larje automatike pas përdorimit duke përdorur solucionet e larjes të ofruara në fishekun e tamponit dhe NaOCl të ofruar në fishekun e reagentit. Kjo larje zgjat rreth 90 minuta. Butoni Home bëhet aktiv pasi të përfundojë larja. Fishekët e përdorur dhe qeliza rrjedhëse mund të lihen në vend deri në ekzekutimin tjetër.

Monitoroni progresin e ekzekutimit
Olink përdor NGS si lexim për të përcaktuar sasinë e një sekuence të njohur në mënyrë që të vlerësojë përqendrimin e një proteine ​​të caktuar në samples (në lidhje me s të tjeraamples). Cilësia e të dhënave nga çdo ekzekutim i renditjes së Eksplore përcaktohet kryesisht nga parametrat QC unike për teknologjinë Olink. Prandaj, metrikat standarde të kontrollit të cilësisë të përdorura në NGS konvencionale, të tilla si Q-score, janë më pak kritike.

Historia e rishikimit

www.olink.com
Vetëm për përdorim kërkimor. Jo për përdorim në procedurat diagnostike.
Ky produkt përfshin një licencë për përdorim jo komercial të produkteve Olink. Përdoruesit komercialë mund të kërkojnë licenca shtesë. Ju lutemi kontaktoni Olink
Proteomics AB për detaje. Nuk ka asnjë garanci, të shprehur apo të nënkuptuar, që shtrihet përtej këtij përshkrimi. Olink Proteomics AB nuk është përgjegjëse për dëmtimin e pronës, dëmtimin personal ose humbjen ekonomike të shkaktuar nga ky produkt.
Marka tregtare e mëposhtme është në pronësi të Olink Proteomics AB: Olink®.
Ky produkt mbulohet nga disa patenta dhe aplikacione për patentë të disponueshme në https://www.olink.com/patents/.
© E drejta e autorit 2021 Olink Proteomics AB. Të gjitha markat tregtare të palëve të treta janë pronë e pronarëve të tyre përkatës. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Suedi
1192, v1.1, 2021-12-13

Dokumentet / Burimet

Olink Explore Sequencing duke përdorur NextSeq 550 [pdf] Manuali i Përdoruesit Eksploroni renditjen duke përdorur NextSeq 550, Eksploroni Sekuencën, duke përdorur NextSeq 550, NextSeq 550

Referencat

• Manuali i Përdoruesit