Olink Verken volgordebepaling met NextSeq 550

Inleiding

Bedoelde gebruik
Olink® Explore is 'n multipleks-immunotoetsplatform vir die ontdekking van menslike proteïenbiomerkers. Die produk is slegs bedoel vir navorsingsgebruik, en nie vir gebruik in diagnostiese prosedures nie. Die laboratoriumwerk sal slegs deur opgeleide laboratoriumpersoneel uitgevoer word. Dataverwerking sal slegs deur opgeleide personeel uitgevoer word. Die resultate is bedoel om deur navorsers gebruik te word in samewerking met ander kliniese of laboratoriumbevindings.

Oor hierdie handleiding
Hierdie gebruikershandleiding verskaf die instruksies wat nodig is om Olink® Explore Libraries op Illumina® NextSeq™ 550 te volgorde. Die instruksies moet streng en eksplisiet gevolg word. Enige afwykings deur die laboratoriumstappe kan lei tot verswakte data. Raadpleeg die Olink® Explore Over voordat u die laboratoriumwerkvloei beginview Gebruikershandleiding vir 'n inleiding tot die platform, insluitend inligting oor reagense, toerusting en dokumentasie wat benodig word, 'n oorview van die werkvloei, sowel as laboratoriumriglyne. Vir instruksies oor hoe om die Olink® Explore-reagensstelle te laat loop, verwys na die toepaslike Olink® Explore-gebruikershandleiding. Vir dataverwerking en ontleding van die Olink® Explore-volgorderesultate, verwys na die Olink® MyData Cloud-gebruikersgids. Alle handelsmerke en kopiereg vervat in hierdie materiaal is die eiendom van Olink® Proteomics AB, tensy anders vermeld.

Tegniese ondersteuning
Vir tegniese ondersteuning, kontak Olink Proteomics by support@olink.com.

Laboratorium instruksies

Hierdie hoofstuk verskaf instruksies oor hoe om Olink-biblioteke op NextSeq™ 550 te volgorde deur gebruik te maak van die NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 siklusse). Die protokol wat vir volgordebepaling gebruik word, is 'n aanpassing van die Illumina®-standaard NGS-werkvloei vir Illumina® NextSeq™ 550. Voordat u met volgordebepaling voortgaan, maak seker dat die kwaliteit van die gesuiwerde Biblioteek geverifieer is. Verwys na die toepaslike Olink Explore-gebruikershandleiding vir instruksies oor kwaliteitbeheer.

Beplan die opeenvolging
Een Olink-biblioteek kan per NextSeq™ 550 High Output-vloeisel en per lopie gerangskik word. Die aantal hoë-uitsetvloeiselle en lopies wat nodig is om die verskillende Olink Explore-reagensstelle in volgorde te plaas, word in Tabel 1 beskryf. Indien meer as een lopie benodig word, herhaal die instruksies wat in hierdie handleiding beskryf word.

Tabel 1. Volgorde-lopiebeplanning:

Olink® Explore Reagent Kit	Aantal Olink-biblioteke	Aantal vloeisel(s) en lopie(s)
Olink® Explore 384 Reagenset	1	1
Olink® Explore 4 x 384 Reagenset	4	4
Olink® Explore 1536 Reagenset	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 3072 Reagenset	8	8

Installeer Olink® pasgemaakte resep
Tydens hierdie stap word die Olink®-pasgemaakte resep op die NextSeq™ 550 geïnstalleer. Hierdie stap hoef slegs een keer uitgevoer te word, voordat 'n Olink-volgordelopie vir die eerste keer uitgevoer word.
LET WEL: Die Olink pasgemaakte resep sal net werk met die NextSeq™ 500/550 High Output Kits en die NextSeq™ Control Software 4.0

1. Pak uit en plaas die Olink-pasgemaakte resep Olink_NSQ550_HighOutput_V1 in die volgende vouer van die NextSeq™ 550-instrument: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
2. Aktiveer pasgemaakte resepte onder Stelselaanpassing > Bestuur instrument. Indien nie gekies nie, sal die pasgemaakte resep-opsie nie tydens die loop-opstelling verskyn nie.

LET WEL: In die NCS 4.0-sagtewareweergawe sal die opsie om 'n pasgemaakte resep te kies slegs plaasvind nadat die reagenspatroon gelaai is, nie in die vroeëre opstellingbladsy nie.
LET WEL: Die lopie moet in handmatige modus gestel word om persoonlike resepte toe te laat.

Berei volgordebepalingsreagense voor

Tydens hierdie stap word die reagenspatroon wat groeperings- en volgordebepalingsreagense bevat, ontdooi en die vloeisel word voorberei.

Berei reagenspatroon voor
WAARSKUWING: Die reagenspatroon bevat potensieel gevaarlike chemikalieë. Dra voldoende beskermende toerusting en gooi gebruikte reagense weg in ooreenstemming met toepaslike standaarde. Vir meer inligting, verwys na die Illumina NextSeq 550-stelselgids (dokument #15069765).

Berei bank voor

• 1x NextSeq™ 500/550 hoë-uitset reagenspatroon v2 (75 siklusse).

Instruksies

1. Plaas die bevrore reagenspatroon half ondergedompel in kamergetemperde water en laat dit vir 1 uur ontdooi. Maak seker dat alle reagensreservoirs van die patrone heeltemal ontdooi is.
   LET WEL: Gerieflikheidshalwe, ontdooi die patroon die vorige dag en bêre dit oornag by 4 °C. By hierdie temperatuur is reagense tot een week stabiel.
2. Droog die patroonbasis deeglik met 'n papierhanddoek en vee die foelie seëls droog met 'n pluisvrye sneesdoekie indien nodig.
3. Keer die patroon tien keer om om die ontdooide reagense deeglik te meng.
4. Tik die patroon liggies op die bank om lugborrels te verwyder. Berg die patroon by kamertemperatuur as dit binne 4 uur gebruik gaan word.

Berei vloeisel voor

Berei bank voor

• 1x NextSeq™ 500/550 hoë uitsetvloeisel v2.5.

Instruksies

1.  Bring die verkoelde vloeisel vir 30 minute tot kamertemperatuur.
2.  Trek nuwe poeiervrye handskoene aan (om te verhoed dat die glasoppervlak van die vloeisel besoedel word).
3.  Wanneer gereed is om die vloeisel in die instrument te laai, verwyder die vloeisel uit die verpakking en die plastiek klapdop.
4.  Inspekteer die vloeisel. As deeltjies of stof sigbaar is op enige van die glasoppervlakke, maak die toepaslike oppervlak skoon met 'n pluisvrye isopropylalkohol-doek en droog dit met 'n lae-pluis laboratoriumdoekie.

Berei Olink®-biblioteek voor vir volgordebepaling

Tydens hierdie stap word NaOH- en Tris-HCl-verdunnings voorberei, en die gesuiwerde en kwaliteitbeheerde Olink-biblioteek word in opeenvolgende stappe verdun en gedenatureer.

Berei NaOH-verdunning voor
Die NaOH-verdunning word gebruik om die biblioteke te denatureer.

Berei bank voor

• 1 N NaOH voorraad
• MilliQ water
• 1x mikrosentrifugeerbuis (1.5 ml)
• Handpipet (10-100 μL)
• Filter pipetpunte

Voordat jy begin
Merk die mikrosentrifugebuis “NaOH”.

Instruksies

1. Berei 'n 0.2 N NaOH-verdunning in die NaOH-buis volgens Tabel 2 voor.
2. Vortex die NaOH-buis deeglik en draai af. Gebruik binne 12 uur.

Tabel 2. 0.2 N NaOH verdunning

Reagens	Volume (μL)
MilliQ water	80
1 N NaOH voorraad	20

2.4.2 Berei Tris-HCl-verdunning voor
Die Tris-HCl-verdunning word gebruik om die gedenatureerde Biblioteek te neutraliseer.

Berei bank voor

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 voorraad (Trizma® hidrochloried oplossing)
• MilliQ water
• 1x mikrosentrifugeerbuis (1.5 ml)
• Handpipet (10-100 μL)
• Filter pipetpunte

Voordat jy begin

• Merk die mikrosentrifugebuis "Tris-HCl"

Instruksies

1. Berei 'n 200 mM Tris-HCl-verdunning in die Tris-HCl-buis volgens Tabel 3 voor.
2. Vortex die Tris-HCl-buis deeglik en draai dit af.

Tabel 3. 200 mM Tris-HCl verdunning:

Reagens	Volume (μL)
MilliQ water	80
1M Tris-HCl pH 7.0 voorraad (Trizma® hidrochloried oplossing)	20

Verdun Olink® biblioteke
Tydens hierdie stap word die gesuiwerde en kwaliteitbeheerde Olink-biblioteek 1:33 verdun.

Berei bank voor

• Lib Tube, voorberei volgens die toepaslike Olink Explore-gebruikershandleiding
• MilliQ water
• 1x mikrosentrifugeerbuis (1.5 ml)
• Handpipette (0.5-10 en 100-1000 μL)
• Filter pipetpunte

Voordat jy begin

• Ontdooi die Lib Tube as dit gevries is.
• Merk die nuwe mikrosentrifugeerbuis: “Dil”.

Instruksies

1. Voeg 96 μL MilliQ-water by die Dil-buis.
2. Vortex die Lib Tube en draai dit kortliks af.
3. Dra 3 μL van die Lib Tube oor na die Dil Tube.
4. Vortex die Dil Tube en draai dit kortliks af

Denatureer en verdun Olink® Library tot die finale laaikonsentrasie
Tydens hierdie stap word die verdunde Olink-biblioteek gedenatureer en verder verdun tot die finale laaikonsentrasie.

Berei bank voor

• Dil Tube, voorberei in vorige stap
• 0.2 N NaOH-verdunning, vars voorberei in vorige stap
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) verdunning, voorberei in vorige stap
• Hibridiseringsbuffer 1 (HT1) ingesluit in die NextSeq™ Accessory Box v2
• 2x mikrosentrifugeerbuise (1.5 mL en 2 mL)
• Handpipette (0.5-10 en 100-1000 μL)
• Filter pipetpunte

Voordat jy begin

• Ontdooi die bevrore HT1-buffer by kamertemperatuur. Berg by +4 °C tot gebruik.
• Merk die nuwe 1.5 mL mikrosentrifugeerbuis: "Den" (vir die gedenatureerde Biblioteek).
• Merk die nuwe 2 mL mikrosentrifugeerbuis: "Seq" (vir die gereed om biblioteek te laai).

Instruksies

1. Dra 5 μL van die Dil-buis oor na die Den Tube.
2. Voeg 5 μL 0.2 N NaOH by die Den Tube.
3. Vortex die Den Tube en draai dit kortliks af.
4. Inkubeer die Den Tube vir 5 minute by kamertemperatuur om die Biblioteek te denatureer.
5. Voeg 5 μL 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) by die Den Tube om die reaksie te neutraliseer.
6. Vortex die Den Tube en draai dit kortliks af.
7. Voeg 985 μL voorafverkoelde HT1 by die Den Tube.
8. Vortex die Den Tube en draai dit kortliks af. Die buis kan by +4 °C gestoor word tot gebruik (dieselfde dag).
9. Dra 205 μL van die Den Tube na die Seq Tube oor.
10. Voeg 1095 μL voorafverkoelde HT1 by die Seq Tube.
11. Keer die Seq Tube om om die reagense te meng en draai dit kortliks af. Die finale laaivolume is 1.3 ml.
12. Gaan dadelik voort na 2.5 Voer Olink®-volgordelopie uit.

Voer Olink®-volgordelopie uit

Tydens hierdie stap word die bufferpatroon, die vloeisel en die voorbereide reagenspatroon wat die Olink-biblioteek bevat, in die NextSeq 550 gelaai, en die volgordebepaling word begin deur die Olink-pasgemaakte resep te gebruik.

Berei bank voor

• Seq Tube (met gereed om biblioteek te laai), voorberei in vorige stap
• 1x NextSeq™ 500/550 hoë-uitset reagenspatroon v2, voorberei in vorige stap
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, voorberei in vorige stap
• 1x NextSeq™ 500/550 bufferpatroon v2 (75 siklusse), by kamertemperatuur

Stel volgordeloopparameters op
Tydens hierdie stap word opeenvolgingsloopparameters op die NextSeq™ 550 gekies.

1. Op die NextSeq™ 550-tuisskerm, kies Eksperiment.
2. Op die Select Assay-skerm, kies Sequence.
3. In die Run Setup-bladsy, kies Manual run mode en dan Next.
4. Stel die hardloopparameters soos volg op:
   • Voer 'n unieke eksperiment-ID in die Run Name-veld in.
   • In die Biblioteek-ID-veld, voer die ID van die Biblioteek wat jy gebruik in (opsioneel).
   • Kies die Enkellees-opsie in die Leestipe-veld.
   • Voer die aantal siklusse soos volg in:
     • Lees 1:24
     • Indeks 1: 0
     • Indeks 2: 0
     • Lees 2:0
   • Hou die merkblokkie vir gepasmaakte primers ongeselekteer.
   • Stel die uitsetgidsligging vir die huidige lopie rou data. Kies Blaai om die uitsetlêergids te verander.
5. Moenie 'n S opstel nieampdie Blad.
6. Kies Reinig verbruiksgoedere vir hierdie lopie.
7. Kies Volgende.

Laai vloeisel in NextSeq™ 550

1. Verwyder die gebruikte vloeisel uit die vorige lopie.
2. Plaas die nuwe voorbereide vloeisel op die stage.
3. Kies Laai. Die deur word outomaties toegemaak.
4. Wanneer die vloeisel-ID op die skerm verskyn en die sensors in groen gemerk is, kies Volgende

Maak die reagenshouer leeg
WAARSKUWING: Hierdie stel reagense bevat potensieel gevaarlike chemikalieë. Dra voldoende beskermende toerusting en gooi gebruikte reagense weg in ooreenstemming met toepaslike standaarde. Vir meer inligting, verwys na die Illumina NextSeq 550-stelselgids.

1. Maak die deur van die bufferkompartement oop, verwyder die houer met gebruikte reagense uit die onderste kompartement en doen weg met die inhoud in ooreenstemming met toepaslike standaarde.
2. Skuif die leë reagenshouer terug in die onderste bufferkompartement. 'n Hoorbare klik dui aan dat die houer korrek geplaas is.

Laai bufferpatroon

1. Verwyder die gebruikte bufferpatroon uit die boonste bufferkompartement en doen weg met die inhoud in ooreenstemming met toepaslike standaarde.
2. Skuif 'n nuwe bufferpatroon in die boonste bufferkompartement. 'n Hoorbare klik dui aan dat die patroon korrek geplaas is. Maak seker dat die bufferpatroon-ID op die skerm verskyn en dat die sensors in groen gemerk is.
3. Maak die deur van die bufferkompartement toe en kies Volgende.

Laai reagenspatroon

1. Maak die deur van die reagenskompartement oop, verwyder die gebruikte reagenspatroon en doen weg met die ongebruikte inhoud in ooreenstemming met toepaslike standaarde. Die reservoir by posisie 6 is verwyderbaar om veilige wegdoening te vergemaklik.
2. Boor die seël van die reservoir #10 gemerk as "Laai biblioteek hier" met 'n skoon 1 ml pipetpunt.
3. Laai 1.3 ml die Olink-biblioteek van die Seq-buis in reservoir #10 gemerk as "Laai biblioteek hier".
4. Skuif die nuwe reagenspatroon in die reagenskompartement en maak die reagenskompartementdeur toe.
5. Kies Laai en wag vir ~30 sekondes totdat die reagenspatroon-ID op die skerm verskyn en die sensors in groen gemerk is.
6. Kies die [Gepasmaakte] "Olink_NSQ550_HighOutput_V1"-resepopsie vanaf die Resep-aftreklys.
7. Kies Volgende.

Begin opeenvolging hardloop

1. Bevestig die hardloopparameters wat op die Review skerm. Om enige parameters te wysig, druk Terug om terug te keer na die Run Setup-skerm.
2. Kies Volgende. Die lopie begin na 'n outomatiese voorlopie-kontrole. Die opeenvolgende looptyd is ongeveer 7h30 min.
3. Maak die werkarea skoon.

LET WEL: Wanneer die opeenvolgingslopie voltooi is, begin die sagteware 'n outomatiese naloopwas met behulp van die wasoplossings wat in die bufferpatroon en die NaOCl voorsien word in die reagenspatroon. Hierdie was duur ongeveer 90 minute. Die Home-knoppie word aktief sodra die was voltooi is. Gebruikte patrone en vloeisel kan in plek gelaat word tot die volgende lopie.

Monitor hardloopvordering
Olink gebruik NGS as uitlees om die hoeveelheid van 'n bekende volgorde te kwantifiseer om die konsentrasie van 'n gegewe proteïen in s te skatamples (in verhouding tot ander aamples). Datakwaliteit van elke Explore-volgordelopie word hoofsaaklik bepaal deur QC-parameters wat uniek is aan Olink-tegnologie. Gevolglik is standaard gehaltebeheermaatstawwe wat in konvensionele NGS gebruik word, soos Q-telling, minder krities.

Hersieningsgeskiedenis

Weergawe	Datum	Beskrywing
1.1	2021-12-13	Redaksionele veranderinge
1.0	2021-12-01	Nuut

www.olink.com
Slegs vir navorsingsgebruik. Nie vir gebruik in diagnostiese prosedures nie.
Hierdie produk sluit 'n lisensie vir nie-kommersiële gebruik van Olink-produkte in. Kommersiële gebruikers mag bykomende lisensies benodig. Kontak asseblief vir Olink
Proteomics AB vir besonderhede. Daar is geen waarborge, uitdruklik of geïmpliseer, wat verder strek as hierdie beskrywing nie. Olink Proteomics AB is nie aanspreeklik vir eiendomskade, persoonlike besering of ekonomiese verlies wat deur hierdie produk veroorsaak word nie.
Die volgende handelsmerk word deur Olink Proteomics AB besit: Olink®.
Hierdie produk word gedek deur verskeie patente en patentaansoeke beskikbaar by https://www.olink.com/patents/.
© Kopiereg 2021 Olink Proteomics AB. Alle derdeparty-handelsmerke is die eiendom van hul onderskeie eienaars. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B, SE-752 37 Uppsala, Swede
1192, v1.1, 2021-12-13

Dokumente / Hulpbronne

Olink Verken volgordebepaling met NextSeq 550 [pdfGebruikershandleiding Verken Sequencing met NextSeq 550, Verken Sequencing, met NextSeq 550, NextSeq 550

Verwysings

• Gebruikershandleiding