Olink NextSeq 550 Истражете го секвенционирањето

Забелешка за документ

Упатството за корисникот Olink® Explore, doc nr. 1153, е застарено и е заменето со следните документи:

• Olink® Истражувај надview Упатство за употреба, доц бр. 1187
• Упатство за употреба на Olink® Explore 384, доц бр. 1188
• Упатство за употреба на Olink® Explore 4 x 384, доц бр. 1189
• Корисничко упатство за Olink® Explore 1536 & Expansion, доц бр. 1190
• Упатство за употреба на Olink® Explore 3072, доц бр. 1191
• Olink® Explore Sequencing using NextSeq 550 User Manual, doc nr. 1192
• Olink® Explore Sequencing using NextSeq 2000 User Manual, doc nr. 1193
• Olink® Explore Sequencing using NovaSeq 6000 User Manual, doc nr. 1194

Вовед

Наменета употреба

Olink® Explore е мултиплексна имунолошка платформа за откривање на биомаркери за човечки протеин. Производот е наменет само за истражувачка употреба, а не за употреба во дијагностички процедури. Лабораториската работа ќе ја води само обучен лабораториски персонал. Обработката на податоците ќе ја врши само обучен персонал. Резултатите треба да ги користат истражувачите во врска со други клинички или лабораториски наоди.

За овој прирачник

Ова упатство за употреба ги дава упатствата потребни за секвенционирање на Olink® Explore Libraries на Illumina® NextSeq™ 550. Инструкциите мора строго и експлицитно да се следат. Секое отстапување низ лабораториските чекори може да резултира со оштетени податоци. Пред да започнете со лабораторискиот работен тек, консултирајте се со Olink® Explore Overview Упатство за употреба за вовед во платформата, вклучувајќи информации за реагенсите, потребната опрема и документација, надview на работниот тек, како и лабораториски упатства. За инструкции како да се користат комплетите за реагенси Olink® Explore, погледнете го применливото упатство за употреба на Olink® Explore. За обработка на податоци и анализа на резултатите од секвенцата на Olink® Explore, погледнете во упатството за корисникот Olink® NPX Explore. Сите трговски марки и авторски права содржани во овој материјал се сопственост на Olink® Proteomics AB, освен ако не е поинаку наведено.

Техничка поддршка

За техничка поддршка, контактирајте со Olink Proteomics на support@olink.com.

Лабораториски упатства

Ова поглавје дава инструкции за тоа како да се редат библиотеките Olink на NextSeq™ 550 користејќи го NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 циклуси). Протоколот што се користи за секвенционирање е адаптација на работниот тек на стандардот Illumina® NGS за Illumina® NextSeq™ 550. Пред да продолжите со секвенционирањето, проверете дали е потврден квалитетот на прочистената библиотека. За инструкции за контрола на квалитетот, погледнете го применливото упатство за користење на Olink Explore.

Планирајте го секвенционирањето

Една Olink библиотека може да се секвенционира по ќелија за проток на NextSeq™ 550 High Output и по извршување. Бројот на ќелии со висок излез и течења потребни за секвенционирање на различните комплети за реагенси Olink Explore е опишан во Табела 1. Ако е потребно повеќе од едно извршување, повторете ги инструкциите опишани во ова упатство.

Табела 1. Планирање на извршување на секвенционирање

Комплет за реагенси Olink® Explore	Број на библиотеки Олинк	Број на проточни ќелии и работи
Комплет за реагенси Olink® Explore 384	1	1
Комплет за реагенси Olink® Explore 4 x 384	4	4
Комплет за реагенси Olink® Explore 1536	4	4
Комплет за експанзионен реагенс Olink® Explore	4	4
Комплет за реагенси Olink® Explore 3072	8	8

Инсталирајте го сопствениот рецепт на Olink®

За време на овој чекор, приспособениот рецепт на Olink® се инсталира на NextSeq™ 550. Овој чекор треба да се изврши само еднаш, пред да се изврши за прв пат извршување на секвенционирање на Olink.

ЗАБЕЛЕШКА: Прилагодениот рецепт на Olink ќе работи само со комплетите за висок излез NextSeq™ 500/550 и со контролниот софтвер NextSeq™ 4.0.

1. Отпакувајте и ставете го прилагодениот рецепт Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 во следната папка на инструментот NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Контролен софтвер\Recipe\Custom\High\.
2. Под Приспособување на системот > Управување со инструмент, овозможете Приспособени рецепти. Ако не е избрана, опцијата за прилагоден рецепт нема да се појави за време на поставувањето.

ЗАБЕЛЕШКА

• Во верзијата на софтверот NCS 4.0, опцијата за избор на приспособен рецепт ќе се појави само откако ќе се вчита касетата за реагенс, а не на претходната страница за поставување.
• Извршувањето мора да биде поставено во рачен режим за да се дозволат сопствени рецепти.

Подгответе реагенси за секвенционирање

За време на овој чекор, касетата со реагенс што содржи реагенси за групирање и секвенционирање се одмрзнува и ќелијата за проток се подготвува.

Подгответе кертриџ за реагенс

ПРЕДУПРЕДУВАЊЕ: Касетата за реагенс содржи потенцијално опасни хемикалии. Носете соодветна заштитна опрема и фрлете ги употребените реагенси во согласност со важечките стандарди. За повеќе информации, погледнете го системскиот водич на Illumina NextSeq 550 (документ #15069765).

Подгответе клупа

• 1x NextSeq™ 500/550 Картриџ за реагенс со висок излез v2 (75 циклуси).

Инструкции

1. Ставете го замрзнатиот кертриџ со реагенс полупотопен во собна калена вода и оставете го да се одмрзне 1 час. Проверете дали сите резервоари за реагенси на касетите се целосно одмрзнати.
   • ЗАБЕЛЕШКА: За погодност, одмрзнете го кертриџот претходниот ден и чувајте го преку ноќ на 4 °C. На оваа температура, реагенсите се стабилни до една недела.
2. Темелно исушете ја основата на кертриџот со хартиена крпа и исушете ги заптивките на фолијата со марамче без влакненца доколку е потребно.
3. Превртете го кертриџот десет пати за темелно да ги измешате одмрзнатите реагенси внатре.
4. Допрете ја касетата нежно на клупата за да ги отстраните воздушните меури. Чувајте го кертриџот на собна температура доколку се користи во рок од 4 часа.

Подгответе ќелија за проток

Подгответе клупа

• 1x NextSeq™ 500/550 Ќелија со висок излезен проток v2.5.

Инструкции

1. Доведете ја разладената проточна ќелија на собна температура 30 минути.
2. Ставете нови ракавици без прашок (за да избегнете контаминирање на стаклената површина на ќелијата за проток).
3. Кога сте подготвени да ја вчитате проточната ќелија во инструментот, извадете ја проточната ќелија од пакувањето и пластичната школка.
4. Проверете ја ќелијата за проток. Ако на која било од стаклените површини се видливи честички или прашина, исчистете ја применливата површина со салфетка со изопропил алкохол без влакненца и исушете ја со лабораториско марамче со малку влакна.

Подгответе Olink® библиотека за секвенционирање

За време на овој чекор, се подготвуваат разредувањата на NaOH и Tris-HCl, а прочистената и контролирана со квалитет Olink библиотека се разредува и денатурира во последователни чекори.

Подгответе разредување на NaOH

• Разредувањето на NaOH се користи за денатурација на библиотеките.

Подгответе клупа

• 1 N залиха на NaOH
• MilliQ вода
• 1x цевка за микроцентрифуга (1.5 mL)
• Рачна пипета (10–100 μL)
• Врвови за пипети за филтрирање

Пред да започнете

• Обележете ја цевката за микроцентрифуга „0.2 N NaOH“.

Инструкции

1. Подгответе разредување 0.2 N NaOH во цевката 0.2 N NaOH според Табела 2.
2. Темелно извијте ја цевката од 0.2 N NaOH и завртете ја надолу. Користете во рок од 12 часа.

Табела 2. Разредување на 0.2 N NaOH

Реагенс	Волумен (μL)
MilliQ вода	80
1 N залиха на NaOH	20

Подгответе разредување Tris-HCl

• Разредувањето Tris-HCl се користи за неутрализирање на денатурираната библиотека.

Подгответе клупа

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 (раствор на хидрохлорид Trizma®)
• MilliQ вода
• 1x цевка за микроцентрифуга (1.5 mL)
• Рачна пипета (10–100 μL)
• Врвови за пипети за филтрирање

Пред да започнете

• Обележете ја цевката за микроцентрифуга „Tris-HCl“

Инструкции

1. Подгответе 200 mM Tris-HCl разредување во Tris-HCl цевката според Табела 3.
2. Темелно извртувајте ја цевката Tris-HCl и завртете ја надолу.

Табела 3. 200 mM Tris-HCl разредување

Реагенс	Волумен (μL)
MilliQ вода	80
1M Tris-HCl со pH 7.0 (раствор на хидрохлорид Trizma®)	20

Разредете ги библиотеките Olink®

• За време на овој чекор, прочистената и контролирана со квалитет Olink библиотека се разредува 1:33.

Подгответе клупа

• Lib Tube, подготвен во согласност со применливиот кориснички прирачник Olink Explore
• MilliQ вода
• 1x цевка за микроцентрифуга (1.5 mL)
• Рачни пипети (0.5-10 и 100-1000 μL)
• Врвови за пипети за филтрирање

Пред да започнете

• Одмрзнете ја цевката Lib ако е замрзната.
• Означете ја новата микроцентрифуга цевка: „Дил“.

Инструкции

1. Додадете 96 μL MilliQ вода во Dil Tube.
2. Завртете ја цевката Lib и накратко завртете ја надолу.
3. Префрлете 3 μL од Lib Tube во Dil Tube.
4. Завртете ја Dil Tube-та и завртете ја накратко.

ЗАБЕЛЕШКА: Чувајте ги Lib Tube(ите) на -20 °C во случај на потенцијално повторување(и).

Денатурирајте и разредете го Olink® Library до крајната концентрација на полнење

За време на овој чекор, разредената Olink библиотека се денатурира и дополнително се разредува до крајната концентрација на вчитување.

Подгответе клупа

• Dil Tube, подготвена во претходниот чекор
• 0.2 N NaOH разредување, свежо подготвен во претходниот чекор
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) разредување, подготвено во претходниот чекор
• Хибридизациски бафер 1 (HT1) вклучен во кутијата за додатоци NextSeq™ v2
• 2 x микроцентрифуги цевки (1.5 mL и 2 mL)
• Рачни пипети (0.5-10 и 100-1000 μL)
• Врвови за пипети за филтрирање

Пред да започнете

• Одмрзнете го замрзнатиот HT1 пуфер на собна температура. Да се ​​чува на +4 °C до употреба.
• Обележете ја новата микроцентрифуга цевка од 1.5 mL: „Ден“ (за денатурираната библиотека).
• Обележете ја новата микроцентрифуга цевка од 2 mL: „Seq“ (за библиотека подготвена за вчитување).

Инструкции

1. Префрлете 5 μL од Dil Tube во Den Tube.
2. Додадете 5 μL од 0.2 N NaOH во Ден цевката.
3. Завртете ја цевката за дувло и завртете ја накратко.
4. Инкубирајте ја Den Tube 5 минути на собна температура за да ја денатурирате библиотеката.
5. Додадете 5 μL од 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) во Den Tube за да ја неутрализирате реакцијата.
6. Завртете ја цевката за дувло и завртете ја накратко.
7. Додадете 985 μL претходно разладено HT1 во Den Tube.
8. Завртете ја цевката за дувло и завртете ја накратко. Цевката може да се чува на +4 °C до употреба (ист ден).
9. Префрлете 205 μL од Den Tube во Seq Tube.
10. Додадете 1095 μL претходно разладено HT1 во Seq Tube.
11. Превртете ја Seq Tube за да се измешаат реагенсите и накратко завртете ја надолу. Конечниот волумен на полнење е 1.3 mL.
12. Веднаш продолжете до 2.5 Изведете секвенционирање на Olink®.

Изведете секвенционирање на Olink®

За време на овој чекор, тампон-кертриџот, проточната ќелија и подготвената касета со реагенс што ја содржи библиотеката Olink се вчитуваат во NextSeq 550, а секвенционирањето започнува со користење на приспособениот рецепт Olink.

Подгответе клупа

• Seq Tube (со библиотека подготвена за вчитување), подготвена во претходниот чекор
• 1x NextSeq™ 500/550 кертриџ за реагенс со висок излез v2, подготвен во претходниот чекор
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, подготвена во претходниот чекор
• 1x NextSeq™ 500/550 Buffer Cartridge v2 (75 циклуси), на собна температура

Поставете параметри за извршување на секвенционирање

За време на овој чекор, параметрите за извршување на секвенционирање се избираат на NextSeq™ 550.

1. На почетниот екран NextSeq™ 550, изберете Експеримент.
2. На екранот Select Assay, изберете Sequence.
3. На страницата Run Setup, изберете Manual run mode, а потоа Next.
4. Поставете ги параметрите за извршување на следниов начин:
   • Во полето Run Name, внесете единствен ID на експериментот.
   • Во полето ID на библиотека, внесете го ID на библиотеката што ја користите (опционално).
   • Во полето Тип на читање, изберете ја опцијата Еднократно читање.
   • Внесете го бројот на циклуси на следниов начин:
     • Прочитајте 1: 24
     • Индекс 1: 0
     • Индекс 2: 0
     • Прочитајте 2: 0
     • ВАЖНО: Од клучно значење е Читање 1 да биде поставено на 24, инаку целото извршување ќе пропадне.
   • Чувајте го полето за избор за приспособени буквари неизбрано.
   • Поставете ја локацијата на излезната папка за тековните необработени податоци. Изберете Преглед за да ја промените локацијата на излезната папка.
5. Не поставувајте SampЛе Лист.
6. Изберете Purge consumables за оваа серија.
7. Изберете Следно.

Вчитајте проточна ќелија во NextSeq™ 550

1. Отстранете ја искористената проточна ќелија од претходното извршување.
2. Ставете ја новата подготвена ќелија за проток на stage.
3. Изберете Вчитај. Вратата автоматски се затвора.
4. Кога на екранот ќе се појави ID на проточната ќелија и сензорите се проверуваат во зелено, изберете Next.

Испразнете го садот за реагенс

ПРЕДУПРЕДУВАЊЕ: Овој сет на реагенси содржи потенцијално опасни хемикалии. Носете соодветна заштитна опрема и фрлете ги употребените реагенси во согласност со важечките стандарди. За повеќе информации, погледнете во Водичот за системот Illumina NextSeq 550.

1. Отворете ја вратата од тампон-преградата, извадете го контејнерот со потрошените реагенси од долната преграда и фрлете ја содржината во согласност со важечките стандарди.
2. Повлечете го празниот сад за реагенс назад во долниот тампон. Звучен клик покажува дека контејнерот е правилно поставен.

Вчитајте кертриџ за тампон

1. Отстранете ја искористената касета за тампон од горниот тампон и фрлете ја содржината во согласност со важечките стандарди.
2. Повлечете нова касета за тампон во горната тампон. Звучен клик покажува дека касетата е правилно поставена. Проверете дали ID на касетата за тампон се појавува на екранот и дека сензорите се проверени во зелено.
3. Затворете ја вратата од тампон-преградата и изберете Следно.

Ставете ја касетата со реагенс

1. Отворете ја вратата од преградата за реагенс, извадете ја искористената касета со реагенс и фрлете ја неискористената содржина во согласност со важечките стандарди. Резервоарот на позиција 6 може да се отстрани за да се олесни безбедното отстранување.
2. Прободете го заптивката на резервоарот #10 означен како „Load Library Here“ со чист врв на пипета од 1 ml.
3. Вчитајте 1.3 mL на Olink библиотеката од Seq Tube во резервоарот #10 означен како „Load Library Here“.
4. Повлечете ја новата касета со реагенс во преградата за реагенс и затворете ја вратата од одделот за реагенс.
5. Изберете Load и почекајте ~30 секунди додека ID на касетата за реагенс не се појави на екранот и сензорите не се проверат во зелено.
6. Од паѓачката листа Рецепт, изберете ја опцијата за рецепт [Custom] „Olink_NSQ550_HighOutput_V1“.
   • ВАЖНО: Проверете дали прилагодениот рецепт бил претходно инсталиран во инструментот. Погледнете во 2.2 Инсталирајте го прилагодениот рецепт на Olink®.
7. Изберете Следно.

1. Потврдете ги параметрите за извршување прикажани на Review екран. За да ги уредите сите параметри, притиснете Назад за да се вратите на екранот Run Setup.
2. Изберете Следно. Трчањето започнува по автоматска проверка пред стартување. Времето на извршување на секвенционирањето е приближно 7h30 мин.
3. ВАЖНО: Проверете дали трчањето започнува кога ќе заврши автоматската проверка пред стартување (~5 минути).
   1. ЗАБЕЛЕШКАЗа какви било неуспеси во проверката пред стартување, погледнете ги упатствата на производителот.
   2. ЗАБЕЛЕШКА: Внимавајте да не налетате или на друг начин да го нарушите NextSeq™ 550 за време на извршувањето на секвенционирањето. Инструментот е чувствителен на вибрации.
4. Исчистете ја работната површина.
   1. ЗАБЕЛЕШКА: Кога ќе заврши извршувањето на секвенционирањето, софтверот иницира автоматско перење после пуштање со користење на растворите за миење дадени во тампон кертриџот и NaOCl обезбедени во касетата со реагенс. Ова миење трае приближно 90 минути. Копчето Home станува активно откако ќе заврши миењето. Искористените касети и ќелијата за проток може да се остават на место до следното пуштање.

Следете го напредокот на трчањето

Олинк користи NGS како отчитување за да ја измери количината на позната низа со цел да ја процени концентрацијата на даден протеин во samples (во однос на другите сamples). Квалитетот на податоците од секое извршување на секвенционирање на Explore главно се определува со параметрите за QC уникатни за технологијата Olink. Оттука, стандардните метрики за контрола на квалитетот што се користат во конвенционалните NGS, како што е Q-score, се помалку критични.

Историја на ревизии

Верзија	Датум	Опис
1.2	2022-11-01	1.2 Го замени Olink® Mydata со Olink® NPX Explore. 2.4 Додадено е 0.2 N на Пред да започнете.
1.1	2021-12-13	Уреднички промени
1.0	2021-12-01	Ново

www.olink.com

Само за истражувачка употреба. Не е за употреба во дијагностички процедури.

Овој производ вклучува лиценца за некомерцијална употреба на производите на Olink. Комерцијалните корисници може да бараат дополнителни лиценци. Ве молиме контактирајте со Olink Proteomics AB за детали. Нема гаранции, изразени или имплицирани, кои се протегаат надвор од овој опис. Olink Proteomics AB не е одговорен за имотна штета, лична повреда или економска загуба предизвикана од овој производ. Следната трговска марка е во сопственост на Olink Proteomics AB: Olink®. Овој производ е покриен со неколку патенти и апликации за патенти достапни на https://www.olink.com/patents/.

© Авторски права 2021 Olink Proteomics AB. Сите заштитни знаци на трета страна се сопственост на нивните соодветни сопственици.
Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Sweden
1192, v1.2, 2022-11-01

Документи / ресурси

Olink NextSeq 550 Истражете го секвенционирањето [pdf] Упатство за користење NextSeq 550 Истражување на секвенционирање, NextSeq 550, Истражување на секвенционирање, секвенционирање

Референци

• Упатство за употреба