Olink NextSeq 550 Explore Sequencing Manuale d'utilizatore

Olink® Explore hè una piattaforma di immunoassay multiplex per a scuperta di biomarcatori di proteine umani. U pruduttu hè destinatu solu per l'usu di ricerca, è micca per l'usu in prucessi di diagnostichi. U travagliu di u laboratoriu deve esse realizatu solu da u persunale di laboratoriu furmatu. U trattamentu di e dati deve esse realizatu solu da u persunale furmatu. I risultati sò destinati à esse aduprati da i circadori in cunghjunzione cù altre scuperte cliniche o di laboratori.

Circa stu manuale

Stu Manuale d'Usuariu furnisce l'istruzzioni necessarii per sequenzià l'Olink® Explore Libraries nantu à Illumina® NextSeq™ 550. L'istruzzioni devenu esse strettamente è esplicitamente seguitu. Qualchese deviazioni in tutte e fasi di u laboratoriu pò esse risultatu in dati deteriorati. Prima di inizià u flussu di travagliu di u laboratoriu, cunsultate l'Olink® Explore Overview User Manual per una introduzione à a piattaforma, cumprese l'infurmazioni nantu à i reagenti, l'equipaggiu è a documentazione necessaria, è sopraview di u flussu di travagliu, è ancu e linee guida di u laboratoriu. Per struzzioni nantu à cumu eseguisce i Kit di Reagenti Olink® Explore, riferite à u Manuale d'Usuariu Olink® Explore applicabile. Per l'elaborazione di dati è l'analisi di i risultati di a sequenza Olink® Explore, riferite à u Manuale d'Usuariu Olink® NPX Explore. Tutti i marchi è i diritti d'autore cuntenuti in stu materiale sò a pruprietà di Olink® Proteomics AB, salvu s'ellu ùn hè micca dettu altrimenti.

Supportu tecnicu

Per supportu tecnicu, cuntattate Olink Proteomics à support@olink.com.

Istruzzioni di u laboratoriu

Stu capitulu furnisce struzzioni nantu à cumu si sequenzianu Biblioteche Olink in NextSeq™ 550 utilizendu u NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cicli). U protokollu utilizatu per a sequenza hè una adattazione di u flussu di travagliu standard NGS Illumina® per Illumina® NextSeq™ 550. Prima di procederà à a sequenza, assicuratevi chì a qualità di a Biblioteca purificata hè stata verificata. Riferite à u Manuale d'Usuariu Olink Explore applicabile per struzzioni nantu à u cuntrollu di qualità.

Pianu a corsa di sequenza

Una libreria Olink pò esse sequenziata per cella di flussu NextSeq™ 550 High Output è per corsa. U nùmeru di cellule di flussu High Output è corse necessarie per sequenza di i diversi Olink Explore Reagent Kits hè descrittu in a Tabella 1. Se più di una corsa hè necessariu, ripetite l'istruzzioni descritti in stu manuale.

Table 1. Sequencing run planning

Olink® Explore Reagent Kit	Numero di Biblioteche Olink	Numero di cellule di flusso e di corsa
Olink® Explore 384 Reagent Kit	1	1
Olink® Explore 4 x 384 Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 1536 Reagent Kit	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 3072 Reagent Kit	8	8

Installa a ricetta persunalizata Olink®

Duranti stu passu, a ricetta persunalizata Olink® hè stallata nantu à u NextSeq™ 550. Stu passu solu deve esse realizatu una volta, prima chì una sequenza di sequenza Olink hè realizata per a prima volta.

NOTA: A ricetta persunalizata Olink funzionerà solu cù i Kits High Output NextSeq™ 500/550 è u Software di Control NextSeq™ 4.0.

Unzip è mette a ricetta persunalizata Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 in u cartulare seguente di l'instrumentu NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
Sottu Persunalizazioni di u Sistema> Gestisce Strumentu, attivate Ricette Personalizzate. Se ùn hè micca sceltu, l'opzione di ricetta persunalizata ùn apparirà micca durante a configurazione di run.

NOTA

In a versione di u software NCS 4.0, l'opzione per selezziunà una ricetta persunalizata sarà solu dopu chì a cartuccia di reagenti hè caricata, micca in a pagina di configurazione precedente.

A corsa deve esse stabilita in modu manuale per permette ricette persunalizate.

Preparate reagenti di sequenza

Duranti stu passu, a cartuccia di reagenti chì cuntene reagenti di clustering è sequencing hè scongelatu è a cellula di flussu hè preparata.

Preparate cartuccia di reagenti

ATTENZIONE: A cartuccia di reagenti cuntene sustanzi chimichi potenzialmente periculosi. Purtate l'equipaggiu protettivu adattatu è scartate i reagenti usati in cunfurmità cù e norme applicabili. Per più infurmazione, riferite à a Guida di Sistema Illumina NextSeq 550 (documentu #15069765).

Preparate u bancu

1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2 (75 cicli).

Istruzzioni

Pone a cartuccia di reagenti congelata à mità immersa in acqua temperata di a stanza è lasciate scongelu per 1 ora. Assicuratevi chì tutti i reservoirs di reagenti di i cartucce sò completamente scongelati.
- NOTA: Per comodità, sconge a cartuccia u ghjornu prima è guardala tutta a notte à 4 ° C. À questa temperatura, i reagenti sò stabile finu à una settimana.
Asciugà a basa di cartuccia bè cù una spugna di carta è sguassate i sigilli di foglia secca cun un tissutu senza filu se necessariu.
Invertite a cartuccia dece volte per mischjà bè i reagenti scongelati.
Tap the cartridge delicatamente nantu à u bancu per sguassà e bolle d'aria. Mantene a cartuccia à a temperatura di l'ambienti se serà usata in 4 ore.

Preparate a cellula di flussu

Preparate u bancu

1x NextSeq™ 500/550 Cella à flussu d'alta produzzione v2.5.

Istruzzioni

Purtate a cellula di flussu refrigerata à a temperatura di l'ambienti per 30 minuti.
Mettite novi guanti senza polvere (per evità di contaminazione di a superficia di vetru di a cellula di flussu).
Quandu hè prontu à carricà a cellula di flussu in l'instrumentu, sguassate a cellula di flussu da u pacchettu è u clamshell di plastica.
Inspeccione a cellula di flussu. Se particulate o polvera sò visibili nantu à qualsiasi superficia di vetru, pulite a superficia applicabile cù una salvietta d'alcool isopropilica senza filu è secca cun un tissutu di laboratoriu pocu filu.

Preparate Olink® Library per a sequenza

Duranti stu passu, i diluzioni NaOH è Tris-HCl sò preparati, è a Biblioteca Olink purificata è cuntrullata di qualità hè diluita è denaturata in passi sequenziali.

Preparate a diluzione di NaOH

A dilution NaOH hè usata per denature i Biblioteche.

Preparate u bancu

1 N NaOH stock
MilliQ acqua
1x Tubu per microcentrifuga (1.5 mL)

Pipetta manuale (10–100 μL)
Filtri puntali di pipette

Prima di principià

Marca u tubu di microcentrifuga "0.2 N NaOH".

Istruzzioni

Preparate una diluzione di NaOH 0.2 N in u Tubu NaOH 0.2 N secondu a Tabella 2.
Vortex the 0.2 N NaOH Tube bè è spin down. Aduprà in 12 ore.

Table 2. Dilution NaOH 0.2 N

Reagente	Volume (μL)
MilliQ acqua	80
1 N NaOH stock	20

Preparate a diluzione di Tris-HCl

A dilution Tris-HCl hè usata per neutralizà a Biblioteca denaturata.

Preparate u bancu

1 M Tris-HCl pH 7.0 (soluzione di cloridrato Trizma®)
MilliQ acqua

1x Tubu per microcentrifuga (1.5 mL)
Pipetta manuale (10–100 μL)
Filtri puntali di pipette

Prima di principià

Marca u tubu di microcentrifuga "Tris-HCl"

Istruzzioni

Preparate una diluzione di Tris-HCl 200 mM in u Tubu Tris-HCl secondu a Tabella 3.
Vortex u Tubu Tris-HCl accuratamente è spinu.

Table 3. 200 mM Tris-HCl dilution

Reagente	Volume (μL)
MilliQ acqua	80
Tris-HCl 1M pH 7.0 (soluzione di cloridrato Trizma®)	20

Diluite Biblioteche Olink®

Duranti stu passu, a Biblioteca Olink purificata è cuntrullata di qualità hè diluita 1:33.

Preparate u bancu

Lib Tube, preparatu secondu u Manuale d'Usuariu Olink Explore applicabile

MilliQ acqua
1x Tubu per microcentrifuga (1.5 mL)
Pipette manuali (0.5–10 e 100–1000 μL)

Filtri puntali di pipette

Prima di principià

Scongelate u Lib Tube se congelate.

Marca u novu tubu microcentrifuge: "Dil".

Istruzzioni

Aghjunghjite 96 μL di acqua MilliQ à u Dil Tube.

Vortex the Lib Tube è girallu brevemente.
Trasferisce 3 μL da u Tubu Lib à u Tubu Dil.
Vortex the Dil Tube è spin it down brevemente.

NOTA: Conservate i Tubi Lib a -20 °C in caso di potenziale ripetizione.

Denature è dilute Olink® Library à a cuncentrazione finale di carica

Duranti stu passu, a Libreria Olink diluita hè denaturata è più diluita à a cuncentrazione finale di carica.

Preparate u bancu

Dil Tube, preparatu in u passu precedente
Dilution NaOH 0.2 N, preparata fresca in u passu precedente
200 mM Tris-HCl (pH 7.0) diluizione, preparata in fase precedente

Buffer di ibridazione 1 (HT1) inclusu in u NextSeq™ Accessory Box v2
2 provette per microcentrifuga (1.5 mL e 2 mL)
Pipette manuali (0.5–10 e 100–1000 μL)

Filtri puntali di pipette

Prima di principià

Scongete u buffer HT1 congelatu à a temperatura di l'ambienti. Mantene à + 4 ° C finu à l'usu.

Marca u novu tubu di microcentrifuga di 1.5 mL: "Den" (per a Biblioteca denaturata).
Marca u novu tubu di microcentrifuga di 2 mL: "Seq" (per a biblioteca pronta per carica).

Istruzzioni

Trasferisce 5 μL da u Dil Tube à u Den Tube.
Aggiungere 5 μL di NaOH 0.2 N al Den Tube.
Vortex the Den Tube è girallu brevemente.

Incubate u Den Tube per 5 minuti à a temperatura di l'ambienti per denature a Biblioteca.
Aggiungere 5 μL di 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) al Den Tube per neutralizzare la reazione.
Vortex the Den Tube è girallu brevemente.

Aghjunghjite 985 μL di HT1 prechilled à u Den Tube.
Vortex the Den Tube è girallu brevemente. U tubu pò esse guardatu à + 4 ° C finu à l'usu (u stessu ghjornu).
Trasferite 205 μL da u Den Tube à u Seq Tube.

Aghjunghjite 1095 μL di HT1 prechilled à u Seq Tube.
Invertite u Seq Tube per mischjà i reagenti è girallu brevemente. U voluminu di carica finali hè 1.3 mL.
Cuntinuà subitu à 2.5 Eseguite l'esecuzione di sequenza Olink®.

Eseguite una corsa di sequenza Olink®

Duranti stu passu, u cartucciu di buffer, a cellula di flussu è u cartucciu di reagenti preparatu chì cuntene a Biblioteca Olink sò caricati in u NextSeq 550, è a sequenza di a sequenza hè iniziata cù a ricetta Olink persunalizata.

Preparate u bancu

Seq Tube (cù a biblioteca pronta per carica), preparatu in u passu precedente

1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, preparatu in u passu precedente
1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, preparatu in u passu precedente
1x Cartuccia tampon NextSeq™ 500/550 v2 (75 cicli), à a temperatura ambiente

Configurate i paràmetri di corsa di sequenza

Duranti stu passu, i paràmetri di l'esecuzione di sequenza sò selezziunati nantu à u NextSeq™ 550.

Nantu à u screnu Home NextSeq™ 550, selezziunate Esperimentu.

In u screnu Select Assay, selezziunate Sequence.
In a pagina Run Setup, selezziunate Modu di esecuzione manuale è dopu Next.
Configurate i paràmetri di corsa cum'è seguente:
- In u campu Run Name, inserite un ID esperimentu unicu.
- In u campu di l'ID di Biblioteca, inserite l'ID di a Biblioteca chì site in esecuzione (opcional).
- In u campu di Tipu di Lettura, selezziunate l'opzione di Lettura Singulu.
- Inserite u numeru di ciculi cum'è seguitu:
  - Leghjite 1: 24
  - Indice 1: 0
  - Indice 2: 0
  - Leghjite 2: 0
  - IMPORTANTE: Hè cruciale chì Read 1 hè stabilitu à 24, altrimenti tutta a corsa falla.
- Mantene a casella di spunta per i primers persunalizati senza selezzione.
- Stabilite u locu di u cartulare di output per i dati grezzi currenti. Selezziunà Sfoglia à cambià u locu cartulare pruduzzioni.
Ùn mette micca un Sample Sheet.

Selezziunate Purge consumables per questa corsa.
Selezziunà Next.

Caricà a cellula di flussu in NextSeq™ 550

Eliminate a cellula di flussu usata da a corsa precedente.
Pone a nova cellula di flussu preparata nantu à u stage.
Selezziunà Load. A porta hè chjusa automaticamente.

Quandu l'ID di a cellula di flussu appare nantu à u screnu è i sensori sò verificati in verde, selezziunate Next.

Svuotate u cuntainer di reagenti

ATTENZIONE: Stu gruppu di reagenti cuntene sustanzi chimichi potenzialmente periculosi. Purtate l'equipaggiu protettivu adattatu è scartate i reagenti usati in cunfurmità cù e norme applicabili. Per più infurmazione, riferite à a Guida di Sistema Illumina NextSeq 550.

Aprite a porta di u compartimentu di tampone, sguassate u cuntainer di reagenti spesi da u compartmentu inferiore, è sguassate u cuntenutu in cunfurmità cù e norme applicabili.

Trascinate u contenitore di reagenti viotu torna in u compartmentu di buffer inferiore. Un clic audible indica chì u cuntinuu hè pusatu currettamente.

Caricà a cartuccia di buffer

Eliminate a cartuccia tampone usata da u compartimentu tampon superiore è sguassate u cuntenutu in cunfurmità cù e norme applicabili.

Trascinate una nova cartuccia tampone in u compartimentu buffer superiore. Un clic audible indica chì a cartuccia hè pusata currettamente. Assicuratevi chì l'ID di cartuccia buffer appare nantu à u screnu è chì i sensori sò verificati in verde.
Chiude a porta di u buffer compartment è selezziunate Next.

Caricà a cartuccia di reagenti

Aprite a porta di u compartmentu di reagenti, sguassate u cartucciu di reagentu utilizatu, è sguassate u cuntenutu inutilizatu in cunfurmità cù e norme applicabili. U reservoir in a pusizioni 6 hè removable per facilità l'eliminazione sicura.
Perforà u sigillo di u reservoir #10 marcatu cum'è "Load Library Here" cù una punta di pipette pulita da 1 mL.
Caricate 1.3 mL di a Biblioteca Olink da u Tubu Seq in u reservoir #10 marcatu cum'è "Load Library Here".
Trascinate a nova cartuccia di reagenti in u compartimentu di reagenti è chjude a porta di u compartimentu di reagenti.
Selezziunate Load è aspettate ~ 30 seconde finu à chì l'ID di cartuccia di reagenti appare nantu à u screnu è i sensori sò verificati in verde.
Da u listinu di ricetta, selezziunate l'opzione di ricetta [Custom] "Olink_NSQ550_HighOutput_V1".
- IMPORTANTE: Assicuratevi chì a ricetta persunalizata hè stata installata prima in u strumentu. Vede a 2.2 Installa a ricetta persunalizata Olink®.
Selezziunà Next.

Accuminciate a sequenza corsa

Cunfirmà i paràmetri di corsa affissati nantu à u Review schermu. Per edità qualsiasi paràmetru, premete Back per vultà à a pantalla Run Setup.
Selezziunà Next. A corsa principia dopu à un cuntrollu automaticu pre-run. U tempu di esecuzione di sequenza hè di circa 7h30 min.
IMPORTANTE: Assicuratevi chì a corsa principia quandu u cuntrollu automaticu pre-run hè statu cumpletu (~ 5 minuti).
1. NOTAPer qualsiasi fallimentu di verificazione pre-run, riferite à l'istruzzioni di u fabricatore.
2. NOTA: Fate attenzione à ùn sbattà o altrimenti disturbà u NextSeq™ 550 durante a corsa di sequenza. U strumentu hè sensibile à vibrazioni.
Pulite l'area di travagliu.
1. NOTA: Quandu a corsa di sequenza hè finita, u software inizia un lavatu automaticu post-run cù e soluzioni di lavaggio furnite in a cartuccia di tampone è u NaOCl furnitu in a cartuccia di reagenti. Stu lavatu dura circa 90 minuti. U buttone Home diventa attivu una volta chì u lavatu hè finitu. Cartucce usate è cellula di flussu ponu esse lasciate in u locu finu à a prossima corsa.

Monitorà u prugressu di a corsa

Olink usa NGS cum'è lettura per quantificà a quantità di una sequenza cunnisciuta per stimà a cuncentrazione di una data proteina in s.amples (par rapportu à l'altri samples). A qualità di dati da ogni corsa di sequenza di Esplora hè principalmente determinata da parametri QC unichi à a tecnulugia Olink. Dunque, e metriche standard di cuntrollu di qualità aduprate in NGS convenzionali, cum'è Q-score, sò menu critichi.

Storia di rivisione

Versione	Data	Descrizzione
1.2	2022-11-01	1.2 Sustituitu Olink® Mydata cù Olink® NPX Explore. 2.4 Aggiuntu 0.2 N à Prima di principià.
1.1	2021-12-13	I cambiamenti editoriali
1.0	2021-12-01	Novu

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Stu pruduttu include una licenza per l'usu non cummerciale di i prudutti Olink. L'utilizatori cummirciali puderanu dumandà licenze supplementari. Per piacè cuntattate Olink Proteomics AB per i dettagli. Ùn ci sò micca garanzie, espresse o implicite, chì si estendenu oltre sta descrizzione. Olink Proteomics AB ùn hè micca rispunsevuli di danni à a pruprietà, ferite persunale, o pèrdite economiche causate da stu pruduttu. A seguente marca hè di proprietà di Olink Proteomics AB: Olink®. Stu pruduttu hè cupartu da parechji brevetti è applicazioni di patenti dispunibili à https://www.olink.com/patents/.

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1192, v1.2, 2022-11-01

Documenti / Risorse

Olink NextSeq 550 Explore Sequencing [pdfManuale d'usu
NextSeq 550 Esplora Sequencing, NextSeq 550, Esplora Sequencing, Sequencing

Referenze

Manuale d'usu

Olink NextSeq 550 Explore Sequencing

Nota di documentu

Introduzione

Istruzzioni di u laboratoriu

Preparate cartuccia di reagenti

Preparate a cellula di flussu

Prima di principià

Diluite Biblioteche Olink®

Denature è dilute Olink® Library à a cuncentrazione finale di carica

Eseguite una corsa di sequenza Olink®

Svuotate u cuntainer di reagenti

Storia di rivisione

Documenti / Risorse

Referenze

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