Olink NextSeq 550 Skoða raðgreiningu

Skjalathugasemd

Olink® Explore notendahandbókin, skjal nr. 1153, er úrelt og hefur verið skipt út fyrir eftirfarandi skjöl:

• Olink® Explore Overview Notendahandbók, skjal nr 1187
• Olink® Explore 384 notendahandbók, skjal nr 1188
• Olink® Explore 4 x 384 notendahandbók, skjal nr 1189
• Olink® Explore 1536 & Expansion notendahandbók, skjal nr 1190
• Olink® Explore 3072 notendahandbók, skjal nr 1191
• Olink® kanna raðgreiningu með því að nota NextSeq 550 notendahandbók, skjal nr 1192
• Olink® kanna raðgreiningu með því að nota NextSeq 2000 notendahandbók, skjal nr 1193
• Olink® Explore Sequencing með NovaSeq 6000 notendahandbók, skjal nr 1194

Inngangur

Fyrirhuguð notkun

Olink® Explore er margfeldi ónæmisprófunarvettvangur fyrir uppgötvun próteina lífmerkja manna. Varan er eingöngu ætluð til rannsóknarnotkunar og ekki til notkunar í greiningaraðgerðum. Rannsóknarstofustarfið skal eingöngu rekið af þjálfuðu starfsfólki rannsóknarstofu. Vinnsla gagna skal einungis fara fram af þjálfuðu starfsfólki. Niðurstöðurnar eru ætlaðar til að nota af vísindamönnum í tengslum við aðrar klínískar niðurstöður eða rannsóknarstofur.

Um þessa handbók

Þessi notendahandbók veitir leiðbeiningarnar sem þarf til að raða Olink® Explore Libraries á Illumina® NextSeq™ 550. Leiðbeiningunum verður að fylgja nákvæmlega og afdráttarlaust. Öll frávik á rannsóknarstofunni geta leitt til skerðingar á gögnum. Áður en vinnuflæði rannsóknarstofu er hafið skaltu hafa samband við Olink® Explore Overview Notendahandbók fyrir kynningu á pallinum, þar á meðal upplýsingar um hvarfefni, búnað og skjöl sem þarf, yfirview verkflæðisins, sem og leiðbeiningar á rannsóknarstofu. Fyrir leiðbeiningar um hvernig á að keyra Olink® Explore hvarfefnissettin, sjá viðeigandi Olink® Explore notendahandbók. Fyrir gagnavinnslu og greiningu á niðurstöðum Olink® Explore röð, skoðaðu Olink® NPX Explore notendahandbókina. Öll vörumerki og höfundarréttur sem er að finna í þessu efni eru eign Olink® Proteomics AB, nema annað sé tekið fram.

Tæknileg aðstoð

Fyrir tæknilega aðstoð, hafðu samband við Olink Proteomics á support@olink.com.

Leiðbeiningar á rannsóknarstofu

Þessi kafli veitir leiðbeiningar um hvernig á að raða Olink bókasöfnum á NextSeq™ 550 með því að nota NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 lotur). Samskiptareglan sem notuð er við raðgreiningu er aðlögun á Illumina® staðlaða NGS vinnuflæðinu fyrir Illumina® NextSeq™ 550. Áður en haldið er áfram í raðgreiningu skaltu ganga úr skugga um að gæði hreinsaða safnsins hafi verið staðfest. Sjá viðeigandi Olink Explore notendahandbók fyrir leiðbeiningar um gæðaeftirlit.

Skipuleggðu röðunina

Hægt er að raða einu Olink safni fyrir hverja NextSeq™ 550 High Output flæðisreit og hverja keyrslu. Fjöldi flæðisfrumna og keyrslna sem þarf til að raða mismunandi Olink Explore hvarfefnissettum er lýst í töflu 1. Ef þörf er á fleiri en einni keyrslu skaltu endurtaka leiðbeiningarnar sem lýst er í þessari handbók.

Tafla 1. Áætlanagerð um röðun keyrslu

Olink® Explore hvarfefnissett	Fjöldi Olink bókasöfnum	Fjöldi flæðifruma og hlaupa
Olink® Explore 384 hvarfefnissett	1	1
Olink® Explore 4 x 384 hvarfefnissett	4	4
Olink® Explore 1536 hvarfefnissett	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 3072 hvarfefnissett	8	8

Settu upp Olink® sérsniðna uppskrift

Í þessu skrefi er Olink® sérsniðna uppskriftin sett upp á NextSeq™ 550. Þetta skref þarf aðeins að framkvæma einu sinni, áður en Olink raðgreining er framkvæmd í fyrsta skipti.

ATH: Sérsniðna Olink uppskriftin virkar aðeins með NextSeq™ 500/550 High Output Kits og NextSeq™ Control Software 4.0.

1. Taktu upp og settu Olink sérsniðnu uppskriftina Olink_NSQ550_HighOutput_V1 í eftirfarandi möppu á NextSeq™ 550 tækinu: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
2. Undir Kerfisaðlögun > Stjórna tæki, virkjaðu sérsniðnar uppskriftir. Ef ekki er valið mun sérsniðna uppskriftarvalkosturinn ekki birtast meðan á keyrslunni stendur.

ATH

• Í NCS 4.0 hugbúnaðarútgáfunni mun möguleikinn á að velja sérsniðna uppskrift aðeins eiga sér stað eftir að hvarfefnishylkið er hlaðið, ekki á fyrri uppsetningarsíðunni.
• Keyrslan verður að vera stillt á handvirka stillingu til að leyfa sérsniðnar uppskriftir.

Undirbúið raðgreiningarhvarfefni

Í þessu skrefi er hvarfefnishylkið sem inniheldur klasa- og raðgreiningarhvarfefni þiðnað og flæðisfruman útbúin.

Undirbúðu hvarfefnishylki

VIÐVÖRUN: Hvarfefnishylkjan inniheldur hugsanlega hættuleg efni. Notið fullnægjandi hlífðarbúnað og fargið notuðum hvarfefnum í samræmi við gildandi staðla. Nánari upplýsingar er að finna í Illumina NextSeq 550 System Guide (skjal #15069765).

Undirbúa bekkinn

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output hvarfefnishylki v2 (75 lotur).

Leiðbeiningar

1. Setjið frosna hvarfefnishylkið hálf á kafi í herbergistempruðu vatni og látið þiðna í 1 klukkustund. Gakktu úr skugga um að öll hvarfefnisgeymir rörlykjanna séu alveg þiðnaðir.
   • ATH: Til þæginda skaltu þíða rörlykjuna daginn áður og geyma hana yfir nótt við 4°C. Við þetta hitastig eru hvarfefni stöðug í allt að eina viku.
2. Þurrkaðu rörlykjubotninn vandlega með pappírsþurrku og þerraðu álpappírsþéttingarnar þurrar með lólausu vefju ef þörf krefur.
3. Hvolfið rörlykjunni tíu sinnum til að blanda þíða hvarfefnin vandlega inn í.
4. Bankaðu létt með rörlykjunni á bekkinn til að fjarlægja loftbólur. Geymið rörlykjuna við stofuhita ef hún verður notuð innan 4 klst.

Undirbúa flæði klefi

Undirbúa bekkinn

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5.

Leiðbeiningar

1. Færið kælda flæðiklefann að stofuhita í 30 mínútur.
2. Settu á þig nýja duftlausa hanska (til að forðast að menga gleryfirborð flæðisfrumunnar).
3. Þegar þú ert tilbúinn til að hlaða flæðisklefanum í tækið skaltu fjarlægja flæðisklefann úr pakkanum og plastklefanum.
4. Skoðaðu flæðisklefann. Ef agnir eða ryk er sjáanlegt á einhverju glerflötanna, hreinsaðu viðeigandi yfirborð með lólausri ísóprópýlalkóhólþurrku og þurrkaðu það með lófalítilli rannsóknarþurrku.

Undirbúðu Olink® Library fyrir raðgreiningu

Í þessu skrefi eru NaOH og Tris-HCl þynningar útbúnar og hreinsað og gæðastýrt Olink safn er þynnt og eðlissvipt í röðum.

Undirbúið NaOH þynningu

• NaOH þynningin er notuð til að denaturera bókasöfnin.

Undirbúa bekkinn

• 1 N NaOH stofn
• MilliQ vatn
• 1x örskilvindu rör (1.5 ml)
• Handvirk pípetta (10–100 μL)
• Síu pípettu ábendingar

Áður en þú byrjar

• Merktu örskilvindurörið „0.2 N NaOH“.

Leiðbeiningar

1. Undirbúið 0.2 N NaOH þynningu í 0.2 N NaOH rörinu samkvæmt töflu 2.
2. Vortex 0.2 N NaOH rörið vandlega og snúið niður. Notist innan 12 klst.

Tafla 2. 0.2 N NaOH þynning

Hvarfefni	Rúmmál (μL)
MilliQ vatn	80
1 N NaOH stofn	20

Undirbúið Tris-HCl þynningu

• Tris-HCl þynningin er notuð til að hlutleysa náttúrulausa safnið.

Undirbúa bekkinn

• 1 M Tris-HCl pH 7.0 stofn (Trizma® hýdróklóríðlausn)
• MilliQ vatn
• 1x örskilvindu rör (1.5 ml)
• Handvirk pípetta (10–100 μL)
• Síu pípettu ábendingar

Áður en þú byrjar

• Merktu örskilvindurörið „Tris-HCl“

Leiðbeiningar

1. Undirbúðu 200 mM Tris-HCl þynningu í Tris-HCl rörinu samkvæmt töflu 3.
2. Vortex Tris-HCl rörið vandlega og snúið því niður.

Tafla 3. 200 mM Tris-HCl þynning

Hvarfefni	Rúmmál (μL)
MilliQ vatn	80
1M Tris-HCl pH 7.0 stofn (Trizma® hýdróklóríðlausn)	20

Þynntu Olink® bókasöfn

• Í þessu skrefi er hreinsað og gæðastýrt Olink safn þynnt 1:33.

Undirbúa bekkinn

• Lib Tube, útbúinn samkvæmt viðeigandi Olink Explore notendahandbók
• MilliQ vatn
• 1x örskilvindu rör (1.5 ml)
• Handvirkar pípettur (0.5–10 og 100–1000 μL)
• Síu pípettu ábendingar

Áður en þú byrjar

• Þiðið Lib Tube ef það er frosið.
• Merktu nýju örskilvindurörið: „Dil“.

Leiðbeiningar

1. Bætið 96 μL af MilliQ vatni í Dil rörið.
2. Vortex Lib Tube og snúðu því niður í stutta stund.
3. Flyttu 3 μL úr Lib Tube yfir í Dil Tube.
4. Vortex Dil Tube og snúðu því niður í stutta stund.

ATH: Geymið Lib Tube(r) við -20 °C ef hugsanlegt er að endursýningar verði endurteknar.

Tengdu og þynntu Olink® Library upp í endanlegt hleðslustyrk

Í þessu skrefi er þynnt Olink-safnið afeðlað og þynnt frekar út í endanlega hleðslustyrk.

Undirbúa bekkinn

• Dil Tube, útbúið í fyrra skrefi
• 0.2 N NaOH þynning, nýbúin í fyrra skrefi
• 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) þynning, útbúin í fyrra skrefi
• Hybridization buffer 1 (HT1) innifalinn í NextSeq™ fylgihlutaboxinu v2
• 2x örskilvindu rör (1.5 ml og 2 ml)
• Handvirkar pípettur (0.5–10 og 100–1000 μL)
• Síu pípettu ábendingar

Áður en þú byrjar

• Þiðið frosinn HT1 jafnalausn við stofuhita. Geymið við +4 °C fram að notkun.
• Merktu nýja 1.5 mL örskilvindu rörið: „Den“ (fyrir náttúrulega safnið).
• Merktu nýju 2 mL örskilvindurörið: „Seq“ (fyrir bókasafnið sem er tilbúið til hleðslu).

Leiðbeiningar

1. Flyttu 5 μL úr Dil rörinu yfir í Den Tube.
2. Bætið 5 μL af 0.2 N NaOH í holrörið.
3. Vortex the Den Tube og snúðu því niður í stutta stund.
4. Ræktaðu Den Tube í 5 mínútur við stofuhita til að denaturera safnið.
5. Bætið 5 μL af 200 mM Tris-HCl (pH 7.0) í Den Tube til að hlutleysa hvarfið.
6. Vortex the Den Tube og snúðu því niður í stutta stund.
7. Bætið 985 μL af forkældu HT1 við Den Tube.
8. Vortex the Den Tube og snúðu því niður í stutta stund. Hægt er að geyma rörið við +4 °C fram að notkun (sama dag).
9. Flyttu 205 μL úr Den Tube í Seq Tube.
10. Bætið 1095 μL af forkældu HT1 við Seq rörið.
11. Hvolfið Seq Tube til að blanda hvarfefnunum og snúið því niður í stutta stund. Lokahleðslurúmmál er 1.3 ml.
12. Haltu strax áfram í 2.5 Framkvæma Olink® raðgreiningu.

Framkvæma Olink® raðgreiningu

Á þessu skrefi er biðminnishylkið, flæðisfruman og tilbúna hvarfefnishylkið sem inniheldur Olink safnið hlaðið inn í NextSeq 550, og raðgreiningin er hafin með Olink sérsniðinni uppskrift.

Undirbúa bekkinn

• Seq Tube (með tilbúið til að hlaða bókasafn), undirbúið í fyrra skrefi
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, útbúið í fyrra skrefi
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, útbúin í fyrra skrefi
• 1x NextSeq™ 500/550 stuðarahylki v2 (75 lotur), við stofuhita

Settu upp færibreytur fyrir raðakstur

Í þessu skrefi eru færibreytur fyrir raðaksturskeyrslu valdar á NextSeq™ 550.

1. Á heimaskjá NextSeq™ 550 velurðu Tilraun.
2. Á Select Assay skjánum, veldu Sequence.
3. Á síðunni Run Setup, veldu Manual run mode og síðan Next.
4. Settu upp keyrslubreyturnar sem hér segir:
   • Í reitnum Run Name skal slá inn einstakt tilraunaauðkenni.
   • Sláðu inn auðkenni bókasafnsins sem þú ert að keyra í reitnum Bókasafnskenni (valfrjálst).
   • Í Read Type reitnum, veldu Single Read valmöguleikann.
   • Sláðu inn fjölda lota sem hér segir:
     • Lestu 1: 24
     • Vísitala 1: 0
     • Vísitala 2: 0
     • Lestu 2: 0
     • MIKILVÆGT: Það skiptir sköpum að Read 1 sé stillt á 24, annars mistekst allt keyrslan.
   • Hafðu gátreitinn fyrir sérsniðna grunna óvalinn.
   • Stilltu staðsetningu úttaksmöppunnar fyrir núverandi hrá gögn. Veldu Vafra til að breyta staðsetningu úttaksmöppunnar.
5. Ekki setja upp Sample Blað.
6. Veldu Purge consumables fyrir þessa keyrslu.
7. Veldu Næsta.

Hlaðið flæðishólfi í NextSeq™ 550

1. Fjarlægðu notaða flæðisreitinn úr fyrri keyrslu.
2. Settu nýja tilbúna flæðiklefann á stage.
3. Veldu Hlaða. Hurðin er sjálfkrafa lokuð.
4. Þegar auðkenni flæðihólfs birtist á skjánum og skynjararnir eru merktir með grænu, veldu Næsta.

Tæmdu hvarfefnisílátið

VIÐVÖRUN: Þetta sett af hvarfefnum inniheldur hugsanlega hættuleg efni. Notið fullnægjandi hlífðarbúnað og fargið notuðum hvarfefnum í samræmi við gildandi staðla. Nánari upplýsingar er að finna í Illumina NextSeq 550 System Guide.

1. Opnaðu hurðina á biðminni, fjarlægðu ílátið fyrir notaða hvarfefni úr neðra hólfinu og fargaðu innihaldinu í samræmi við gildandi staðla.
2. Renndu tóma hvarfefnisílátinu aftur í neðra biðminni. Heyranlegur smellur gefur til kynna að ílátið sé rétt staðsett.

Hlaða biðminni skothylki

1. Fjarlægðu notaða biðminnishylki úr efra biðminnishólfinu og fargaðu innihaldinu í samræmi við gildandi staðla.
2. Renndu nýju biðminnishylki inn í efra biðminnishólfið. Heyranlegur smellur gefur til kynna að rörlykjan sé rétt sett. Gakktu úr skugga um að auðkenni biðhylkisins birtist á skjánum og að skynjararnir séu merktir með grænu.
3. Lokaðu hurðinni á biðminni og veldu Næsta.

Hlaðið hvarfefnishylki

1. Opnaðu hurðina á hvarfefnishólfinu, fjarlægðu notaða hvarfefnishylki og fargaðu ónotuðu innihaldinu í samræmi við gildandi staðla. Geymirinn í stöðu 6 er færanlegur til að auðvelda förgun.
2. Gataðu innsiglið á lóninu #10 merkt sem „Load Library Here“ með hreinum 1 ml pípettuodda.
3. Hladdu 1.3 ml af Olink safninu úr Seq túpunni í lón #10 merkt sem „Load Library Here“.
4. Renndu nýju hvarfefnishylkinu inn í hvarfefnishólfið og lokaðu hurðinni fyrir hvarfefnishólfið.
5. Veldu Hlaða og bíddu í ~30 sekúndur þar til auðkenni hvarfefnishylkja birtist á skjánum og skynjararnir eru merktir með grænu.
6. Í fellilistanum Uppskrift, veldu [Sérsniðin] „Olink_NSQ550_HighOutput_V1“ uppskriftarvalkostinn.
   • MIKILVÆGT: Gakktu úr skugga um að sérsniðna uppskriftin hafi áður verið sett upp í tækinu. Sjá 2.2 Setja upp Olink® sérsniðna uppskrift.
7. Veldu Næsta.

1. Staðfestu keyrslubreyturnar sem sýndar eru á Review skjár. Til að breyta hvaða færibreytum sem er, ýttu á Back til að fara aftur í Run Setup skjáinn.
2. Veldu Næsta. Hlaupið hefst eftir sjálfvirka forkeyrslu. Röðunartíminn er um það bil 7h30 mín.
3. MIKILVÆGT: Gakktu úr skugga um að keyrslan hefjist þegar sjálfvirkri forkeyrsluathugun hefur verið lokið (~5 mínútur).
   1. ATHSjá leiðbeiningar framleiðanda um allar bilanir í eftirliti fyrir keyrslu.
   2. ATH: Gættu þess að rekast ekki á eða trufla á annan hátt NextSeq™ 550 meðan á raðgreiningu stendur. Tækið er viðkvæmt fyrir titringi.
4. Hreinsaðu vinnusvæðið.
   1. ATH: Þegar raðgreiningarkeyrslunni er lokið mun hugbúnaðurinn hefja sjálfvirkan þvott eftir keyrslu með því að nota þvottalausnirnar sem eru í biðminnishylkinu og NaOCl sem fylgir í hvarfefnishylkinu. Þessi þvottur tekur um það bil 90 mínútur. Heimahnappurinn verður virkur þegar þvotti er lokið. Notuð skothylki og flæðisfrumur geta verið eftir á sínum stað þar til næst er keyrt.

Fylgstu með framvindu hlaupa

Olink notar NGS sem útlestur til að mæla magn af þekktri röð til að áætla styrk tiltekins próteins í samples (miðað við önnur samples). Gagnagæði frá hverri Explore raðgreiningu eru aðallega ákvörðuð af QC breytum sem eru einstakar fyrir Olink tækni. Þess vegna eru staðlaðar gæðaeftirlitsmælingar sem notaðar eru í hefðbundnum NGS, eins og Q-stig, minna mikilvægar.

Endurskoðunarsaga

Útgáfa	Dagsetning	Lýsing
1.2	2022-11-01	1.2 Skipti út Olink® Mydata fyrir Olink® NPX Explore. 2.4 Bætt 0.2 N við áður en þú byrjar.
1.1	2021-12-13	Ritstjórnarbreytingar
1.0	2021-12-01	Nýtt

www.olink.com

Aðeins til rannsóknarnotkunar. Ekki til notkunar í greiningaraðferðum.

Þessi vara inniheldur leyfi til notkunar á Olink vörum sem ekki eru í viðskiptalegum tilgangi. Atvinnunotendur gætu þurft viðbótarleyfi. Vinsamlegast hafðu samband við Olink Proteomics AB fyrir frekari upplýsingar. Það eru engar ábyrgðir, tjáðar eða gefnar í skyn, sem ná lengra en þessa lýsingu. Olink Proteomics AB ber ekki ábyrgð á eignatjóni, líkamstjóni eða efnahagslegu tjóni af völdum þessarar vöru. Eftirfarandi vörumerki er í eigu Olink Proteomics AB: Olink®. Þessi vara fellur undir nokkur einkaleyfi og einkaleyfisumsóknir sem fáanlegar eru á https://www.olink.com/patents/.

© Höfundarréttur 2021 Olink Proteomics AB. Öll vörumerki þriðja aðila eru eign viðkomandi eigenda.
Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Svíþjóð
1192, v1.2, 2022-11-01

Skjöl / auðlindir

Olink NextSeq 550 Skoða raðgreiningu [pdfNotendahandbók NextSeq 550 Explore raðgreining, NextSeq 550, Explore raðgreining, raðgreining

Heimildir

• Notendahandbók