Olink NextSeq 550 Explore Sequencing

Заўвага да дакумента

Кіраўніцтва карыстальніка Olink® Explore, дакумент № 1153, састарэла і было заменена наступнымі дакументамі:

• Olink® Explore Overview Кіраўніцтва карыстальніка, дакумент № 1187
• Кіраўніцтва карыстальніка Olink® Explore 384, дакумент № 1188
• Кіраўніцтва карыстальніка Olink® Explore 4 x 384, дакумент № 1189
• Кіраўніцтва карыстальніка Olink® Explore 1536 & Expansion, дакумент № 1190
• Кіраўніцтва карыстальніка Olink® Explore 3072, дакумент № 1191
• Olink® Explore Sequencing with NextSeq 550 Кіраўніцтва карыстальніка, дакумент № 1192
• Olink® Explore Sequencing with NextSeq 2000 Кіраўніцтва карыстальніка, дакумент № 1193
• Olink® Explore Sequencing with NovaSeq 6000 Кіраўніцтва карыстальніка, дакумент № 1194

Уводзіны

Выкарыстанне па прызначэнні

Olink® Explore - гэта мультыплексная платформа імунааналізу для выяўлення біямаркераў чалавечага бялку. Прадукт прызначаны толькі для даследчага выкарыстання, а не для выкарыстання ў дыягнастычных працэдурах. Лабараторныя работы павінны праводзіцца толькі навучаным персаналам лабараторыі. Апрацоўка дадзеных павінна праводзіцца толькі навучаным персаналам. Вынікі прызначаны для выкарыстання даследчыкамі ў спалучэнні з іншымі клінічнымі або лабараторнымі вынікамі.

Аб гэтым дапаможніку

Гэта Кіраўніцтва карыстальніка змяшчае інструкцыі, неабходныя для секвеніравання бібліятэк Olink® Explore на Illumina® NextSeq™ 550. Інструкцыі неабходна строга і выразна выконваць. Любыя адхіленні на працягу лабараторных этапаў могуць прывесці да пагаршэння дадзеных. Перш чым пачаць лабараторны працоўны працэс, пракансультуйцеся з Olink® Explore Overview Кіраўніцтва карыстальніка для азнаямлення з платформай, уключаючы інфармацыю аб рэагентах, неабходным абсталяванні і дакументацыі, аглядview працоўнага працэсу, а таксама лабараторныя рэкамендацыі. Каб атрымаць інструкцыі па запуску набораў рэагентаў Olink® Explore, звярніцеся да адпаведнага Кіраўніцтва карыстальніка Olink® Explore. Для апрацоўкі даных і аналізу вынікаў паслядоўнасці Olink® Explore звярніцеся да Кіраўніцтва карыстальніка Olink® NPX Explore. Усе гандлёвыя маркі і аўтарскія правы, якія змяшчаюцца ў гэтым матэрыяле, з'яўляюцца ўласнасцю Olink® Proteomics AB, калі не пазначана іншае.

Тэхнічная падтрымка

Для атрымання тэхнічнай падтрымкі звяртайцеся ў Olink Proteomics па адрасе support@olink.com.

Лабараторныя інструкцыі

У гэтай главе прыводзяцца інструкцыі аб тым, як секвенировать бібліятэкі Olink на NextSeq™ 550 з выкарыстаннем NextSeq™ 500/550 High Output Kit v2.5 (75 цыклаў). Пратакол, які выкарыстоўваецца для секвенирования, з'яўляецца адаптацыяй стандартнага працоўнага працэсу NGS Illumina® для Illumina® NextSeq™ 550. Перш чым перайсці да секвенирования, пераканайцеся, што якасць вычышчанай бібліятэкі была праверана. Інструкцыі па кантролі якасці звярніцеся да адпаведнага Кіраўніцтва карыстальніка Olink Explore.

Сплануйце запуск паслядоўнасці

Адна бібліятэка Olink можа быць секвеніравана на праточную ячэйку NextSeq™ 550 High Output і на прагон. Колькасць праточных ячэек з высокім выхадам і прагонаў, неабходных для паслядоўнасці розных набораў рэагентаў Olink Explore, апісана ў табліцы 1. Калі патрабуецца больш за адзін запуск, паўтарыце інструкцыі, апісаныя ў гэтым кіраўніцтве.

Табліца 1. Планаванне серыі секвенирования

Набор рэагентаў Olink® Explore	Колькасць бібліятэк Olink	Колькасць праточных ячэек і прагонаў
Набор рэагентаў Olink® Explore 384	1	1
Набор рэагентаў Olink® Explore 4 x 384	4	4
Набор рэагентаў Olink® Explore 1536	4	4
Набор рэагентаў для пашырэння Olink® Explore	4	4
Набор рэагентаў Olink® Explore 3072	8	8

Усталюйце карыстальніцкі рэцэпт Olink®

Падчас гэтага кроку карыстальніцкі рэцэпт Olink® усталёўваецца на NextSeq™ 550. Гэты этап трэба выканаць толькі адзін раз, перад тым, як упершыню выканаць запуск паслядоўнасці Olink.

УВАГА: Спецыяльны рэцэпт Olink будзе працаваць толькі з камплектамі High Output NextSeq™ 500/550 і праграмным забеспячэннем NextSeq™ Control Software 4.0.

1. Распакуйце і змесціце карыстацкі рэцэпт Olink Olink_NSQ550_HighOutput_V1 у наступную папку прыбора NextSeq™ 550: C:\Program Files\Illumina\NextSeq Control Software\Recipe\Custom\High\.
2. У раздзеле «Настройка сістэмы > Кіраванне інструментам» уключыце «Карыстальніцкія рэцэпты». Калі не выбрана, параметр карыстальніцкага рэцэпту не будзе з'яўляцца падчас наладкі запуску.

УВАГА

• У версіі праграмнага забеспячэння NCS 4.0 магчымасць выбару карыстальніцкага рэцэпту з'явіцца толькі пасля загрузкі картрыджа з рэагентам, а не на папярэдняй старонцы налад.
• Прагон павінен быць усталяваны ў ручным рэжыме, каб дазволіць карыстальніцкія рэцэпты.

Прыгатуйце рэагенты для секвенирования

Падчас гэтага этапу картрыдж з рэагентам, які змяшчае рэагенты для кластарызацыі і секвенирования, размарожваецца і праточная ячэйка рыхтуецца.

Падрыхтуйце картрыдж з рэагентам

ПАПЯРЭДЖАННЕ: Картрыдж з рэагентам змяшчае патэнцыйна небяспечныя хімікаты. Апранайце адпаведнае ахоўнае абсталяванне і выкідвайце выкарыстаныя рэагенты ў адпаведнасці з дзеючымі стандартамі. Для атрымання дадатковай інфармацыі звярніцеся да Інструкцыі па сістэме Illumina NextSeq 550 (дакумент № 15069765).

Падрыхтуйце лаўку

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2 (75 цыклаў).

Інструкцыя

1. Змесціце замарожаны картрыдж з рэагентам напалову пагружаным у ваду з пакаёвай тэмпературай і дайце яму адтаць на працягу 1 гадзіны. Пераканайцеся, што ўсе рэзервуары з рэагентамі ў картрыджах цалкам размарожаныя.
   • УВАГА: Для зручнасці размарозьце картрыдж напярэдадні і пакіньце на ноч пры тэмпературы 4 °C. Пры гэтай тэмпературы рэагенты стабільныя да аднаго тыдня.
2. Старанна высушыце аснову картрыджа папяровым ручніком і пры неабходнасці прамакніце ўшчыльнення з фальгі безворсовой сурвэткай.
3. Перавярніце картрыдж дзесяць разоў, каб старанна перамяшаць размарожаныя рэагенты.
4. Акуратна пастукайце картрыджам па лаўцы, каб выдаліць бурбалкі паветра. Захоўвайце картрыдж пры пакаёвай тэмпературы, калі ён будзе выкарыстоўвацца на працягу 4 гадзін.

Падрыхтуйце праточную ячэйку

Падрыхтуйце лаўку

• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5.

Інструкцыя

1. Давядзіце астуджаную праточную ячэйку да пакаёвай тэмпературы на працягу 30 хвілін.
2. Надзеньце новыя непрыпудраныя пальчаткі (каб пазбегнуць забруджвання шкляной паверхні праточнай камеры).
3. Калі вы будзеце гатовыя загрузіць праточную ячэйку ў прыбор, выміце яе з упакоўкі і пластыкавай раскладанкі.
4. Агледзіце праточную ячэйку. Калі на любой са шкляных паверхняў бачныя часціцы або пыл, ачысціце адпаведную паверхню сурвэткай без ворса, змочанай ізапрапілавым спіртам, і вытрыце яе малаворсавай лабараторнай сурвэткай.

Падрыхтуйце бібліятэку Olink® для секвенирования

На гэтым этапе рыхтуюцца развядзенні NaOH і Tris-HCl, а вычышчаная бібліятэка Olink з кантролем якасці разводзіцца і дэнатуруецца ў паслядоўныя этапы.

Прыгатуйце развядзенне NaOH

• Развядзенне NaOH выкарыстоўваецца для дэнатурацыі бібліятэк.

Падрыхтуйце лаўку

• 1 N раствор NaOH
• Вада MilliQ
• 1x мікрацэнтрыфужная прабірка (1.5 мл)
• Ручная піпетка (10–100 мкл)
• Наканечнікі піпеткі фільтра

Перш чым пачаць

• Пазначце прабірку для мікрацэнтрыфугі «0.2 N NaOH».

Інструкцыя

1. Прыгатуйце 0.2 N развядзенне NaOH у прабірцы з 0.2 N NaOH у адпаведнасці з табліцай 2.
2. Старанна змяшайце прабірку з 0.2 N NaOH і закруціце ўніз. Выкарыстаць на працягу 12 гадзін.

Табліца 2. Развядзенне 0.2 N NaOH

Рэагент	Аб'ём (мкл)
Вада MilliQ	80
1 N раствор NaOH	20

Прыгатуйце развядзенне Трыс-HCl

• Развядзенне Tris-HCl выкарыстоўваецца для нейтралізацыі дэнатураванай бібліятэкі.

Падрыхтуйце лаўку

• 1 М трыс-HCl, pH 7.0 (раствор гідрахларыду Trizma®)
• Вада MilliQ
• 1x мікрацэнтрыфужная прабірка (1.5 мл)
• Ручная піпетка (10–100 мкл)
• Наканечнікі піпеткі фільтра

Перш чым пачаць

• Пазначце мікрацэнтрыфужную прабірку "Трыс-HCl"

Інструкцыя

1. Прыгатуйце 200 мм развядзенне Tris-HCl у прабірцы Tris-HCl у адпаведнасці з табліцай 3.
2. Старанна змяшайце прабірку Tris-HCl і закруціце яе ўніз.

Табліца 3. Развядзенне 200 мМ Трыс-HCl

Рэагент	Аб'ём (мкл)
Вада MilliQ	80
1 М трыс-HCl, pH 7.0 (раствор гідрахларыду Trizma®)	20

Развядзіце бібліятэкі Olink®

• На гэтым этапе вычышчаная і кантраляваная якасць бібліятэкі Olink разводзіцца 1:33.

Падрыхтуйце лаўку

• Lib Tube, падрыхтаваны ў адпаведнасці з адпаведным Кіраўніцтвам карыстальніка Olink Explore
• Вада MilliQ
• 1x мікрацэнтрыфужная прабірка (1.5 мл)
• Ручныя піпеткі (0.5–10 і 100–1000 мкл)
• Наканечнікі піпеткі фільтра

Перш чым пачаць

• Размарозьце Lib Tube, калі ён замарожаны.
• Пазначце новую мікрацэнтрыфужную прабірку: "Dil".

Інструкцыя

1. Дадайце 96 мкл вады MilliQ у Dil Tube.
2. Правядзіце Lib Tube на вортэксе і ненадоўга закруціце яго.
3. Перанясіце 3 мкл з прабіркі Lib у прабірку Dil.
4. Змяшайце трубку Dil і ненадоўга закруціце яе ўніз.

УВАГА: Захоўвайце прабірку(-і) Lib пры -20 °C на выпадак магчымага паўторнага(-ых) запуску(-аў).

Дэнатуруйце і развядзіце Olink® Library да канчатковай канцэнтрацыі загрузкі

Падчас гэтага этапу разведзеная бібліятэка Olink дэнатуруецца і дадаткова разводзіцца да канчатковай загрузнай канцэнтрацыі.

Падрыхтуйце лаўку

• Dil Tube, падрыхтаваны на папярэднім этапе
• 0.2 N развядзенне NaOH, свежапрыгатаваны на папярэднім этапе
• Развядзенне 200 мм трыс-HCl (pH 7.0), прыгатаванае на папярэднім этапе
• Буфер гібрыдызацыі 1 (HT1), уключаны ў NextSeq™ Accessory Box v2
• 2 прабіркі для мікрацэнтрыфугі (1.5 мл і 2 мл)
• Ручныя піпеткі (0.5–10 і 100–1000 мкл)
• Наканечнікі піпеткі фільтра

Перш чым пачаць

• Размарозьце замарожаны буфер HT1 пры пакаёвай тэмпературы. Да выкарыстання захоўваць пры тэмпературы +4 °C.
• Пазначце новую мікрацэнтрыфужную прабірку аб'ёмам 1.5 мл: "Den" (для дэнатураванай бібліятэкі).
• Адзначце новую мікрацэнтрыфужную прабірку на 2 мл: «Seq» (для гатовай да загрузкі бібліятэкі).

Інструкцыя

1. Перанясіце 5 мкл з прабіркі Dil у прабірку Den.
2. Дадайце 5 мкл 0.2 N NaOH у прабірку Den.
3. Разбіце Den Tube і ненадоўга закруціце яго.
4. Інкубуйце прабірку Den на працягу 5 хвілін пры пакаёвай тэмпературы, каб дэнатураваць бібліятэку.
5. Дадайце 5 мкл 200 мМ трыс-HCl (pH 7.0) у прабірку Den Tube, каб нейтралізаваць рэакцыю.
6. Разбіце Den Tube і ненадоўга закруціце яго.
7. Дадайце 985 мкл папярэдне астуджанага HT1 у прабірку Den.
8. Разбіце Den Tube і ненадоўга закруціце яго. Цюбік можна захоўваць пры +4 °C да выкарыстання (у той жа дзень).
9. Перанясіце 205 мкл з прабіркі Den у прабірку Seq.
10. Дадайце 1095 мкл папярэдне астуджанага HT1 у прабірку Seq.
11. Перавярніце прабірку Seq Tube, каб змяшаць рэагенты, і ненадоўга закруціце яе. Канчатковы аб'ём загрузкі складае 1.3 мл.
12. Неадкладна перайдзіце да 2.5 Выканайце запуск паслядоўнасці Olink®.

Выканайце запуск паслядоўнасці Olink®

Падчас гэтага кроку буферны картрыдж, праточная ячэйка і падрыхтаваны картрыдж з рэагентамі, які змяшчае бібліятэку Olink, загружаюцца ў NextSeq 550, і запускаецца прагон паслядоўнасці з выкарыстаннем спецыяльнага рэцэпту Olink.

Падрыхтуйце лаўку

• Seq Tube (з гатовай да загрузкі бібліятэкай), падрыхтаваны на папярэднім этапе
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Reagent Cartridge v2, падрыхтаваны на папярэднім этапе
• 1x NextSeq™ 500/550 High Output Flow Cell v2.5, падрыхтаваны на папярэднім этапе
• 1x буферны картрыдж NextSeq™ 500/550 v2 (75 цыклаў), пры пакаёвай тэмпературы

Наладзьце параметры запуску паслядоўнасці

На гэтым этапе на NextSeq™ 550 выбіраюцца параметры серыі секвенирования.

1. На галоўным экране NextSeq™ 550 абярыце Эксперымент.
2. На экране выбару аналізу выберыце паслядоўнасць.
3. На старонцы Run Setup выберыце Manual run mode, а затым Next.
4. Наладзьце параметры запуску наступным чынам:
   • У полі «Назва запуску» увядзіце унікальны ідэнтыфікатар эксперыменту.
   • У полі «Ідэнтыфікатар бібліятэкі» увядзіце ідэнтыфікатар бібліятэкі, якую вы запускаеце (неабавязкова).
   • У полі «Тып чытання» абярыце опцыю «Адзіночнае чытанне».
   • Увядзіце колькасць цыклаў наступным чынам:
     • Прачытайце 1: 24
     • Індэкс 1: 0
     • Індэкс 2: 0
     • Прачытайце 2: 0
     • ВАЖНА: Вельмі важна, каб Read 1 быў усталяваны на 24, у адваротным выпадку ўвесь запуск будзе няўдалым.
   • Не выбірайце сцяжок для карыстацкіх праймераў.
   • Усталюйце размяшчэнне папкі вываду для неапрацаваных даных бягучага запуску. Выберыце «Агляд», каб змяніць месцазнаходжанне папкі вываду.
5. Не наладжвайце Sampле Ліст.
6. Абярыце Ачысціць расходныя матэрыялы для гэтага запуску.
7. Выберыце Далей.

Загрузіце праточную ячэйку ў NextSeq™ 550

1. Выдаліце ​​выкарыстаную праточную ячэйку з папярэдняга запуску.
2. Змесціце новую падрыхтаваную праточную ячэйку на stage.
3. Выберыце Загрузіць. Дзверы аўтаматычна зачыняюцца.
4. Калі на экране з'явіцца ідэнтыфікатар праточнай ячэйкі і датчыкі пазначаны зялёным колерам, выберыце "Далей".

Апаражніце ёмістасць з рэагентам

ПАПЯРЭДЖАННЕ: Гэты набор рэагентаў змяшчае патэнцыйна небяспечныя хімічныя рэчывы. Апранайце адпаведнае ахоўнае абсталяванне і выкідвайце выкарыстаныя рэагенты ў адпаведнасці з дзеючымі стандартамі. Для атрымання дадатковай інфармацыі звярніцеся да Інструкцыі па сістэме Illumina NextSeq 550.

1. Адкрыйце дзверцы буфернага адсека, выміце кантэйнер з адпрацаванымі рэагентамі з ніжняга адсека і ўтылізуйце змесціва ў адпаведнасці з дзеючымі стандартамі.
2. Засуньце пусты кантэйнер для рэагентаў назад у ніжні буферны адсек. Гукавы пстрычка паказвае, што кантэйнер усталяваны правільна.

Загрузіце буферны картрыдж

1. Дастаньце выкарыстаны буферны картрыдж з верхняга буфернага аддзялення і ўтылізуйце змесціва ў адпаведнасці з дзеючымі стандартамі.
2. Устаўце новы буферны картрыдж у верхні буферны адсек. Гукавы пстрычка паказвае, што картрыдж усталяваны правільна. Пераканайцеся, што ідэнтыфікатар буфернага картрыджа з'яўляецца на экране і што датчыкі адзначаны зялёным колерам.
3. Зачыніце дзверцы буфернай камеры і абярыце Далей.

Загрузіце картрыдж з рэагентам

1. Адкрыйце дзверцы адсека для рэагентаў, выміце выкарыстаны картрыдж з рэагентамі і ўтылізуйце нявыкарыстанае змесціва ў адпаведнасці з дзеючымі стандартамі. Рэзервуар у пазіцыі 6 здымаецца для палягчэння бяспечнай утылізацыі.
2. Чыстым наканечнікам піпеткі аб'ёмам 10 мл праткніце ўшчыльненне рэзервуара №1, пазначанае як «Загрузіць сюды бібліятэку».
3. Загрузіце 1.3 мл бібліятэкі Olink з прабіркі Seq у рэзервуар № 10 з надпісам «Загрузіць бібліятэку тут».
4. Засуньце новы картрыдж з рэагентам у адсек для рэагентаў і зачыніце дзверцы адсека для рэагентаў.
5. Выберыце «Загрузіць» і пачакайце ~30 секунд, пакуль на экране не з'явіцца ідэнтыфікатар картрыджа з рэагентам, а датчыкі не стануць правярацца зялёным колерам.
6. У выпадальным спісе "Рэцэпт" абярыце опцыю рэцэпту [Карыстальніцкі] "Olink_NSQ550_HighOutput_V1".
   • ВАЖНА: Пераканайцеся, што карыстацкі рэцэпт быў раней усталяваны ў прыборы. Глядзіце раздзел 2.2 Усталяваць уласны рэцэпт Olink®.
7. Выберыце Далей.

1. Пацвердзіце параметры запуску, якія адлюстроўваюцца на Review экран. Каб змяніць якія-небудзь параметры, націсніце "Назад", каб вярнуцца да экрана "Настройка запуску".
2. Выберыце Далей. Прагон пачынаецца пасля аўтаматычнай праверкі перад прагонам. Працягласць секвенирования складае прыкладна 7 гадзін 30 хвілін.
3. ВАЖНА: Пераканайцеся, што запуск пачынаецца пасля завяршэння аўтаматычнай праверкі перад запуском (~5 хвілін).
   1. УВАГАДля любых памылак пры праверцы перад запускам звярніцеся да інструкцый вытворцы.
   2. УВАГА: Будзьце асцярожныя, каб не сутыкнуцца з NextSeq™ 550 і не патурбаваць яго іншым чынам падчас секвеніравання. Прыбор адчувальны да вібрацыі.
4. Ачысціце працоўную зону.
   1. УВАГА: Калі сеанс секвеніравання завершаны, праграмнае забеспячэнне ініцыюе аўтаматычную прамыўку пасля серыі з выкарыстаннем прамыўных раствораў, якія ўваходзяць у буферны картрыдж, і NaOCl, які змяшчаецца ў картрыдж з рэагентам. Гэта мыццё займае каля 90 хвілін. Кнопка «Дадому» становіцца актыўнай пасля завяршэння мыцця. Выкарыстаныя картрыджы і праточную ячэйку можна пакінуць на месцы да наступнага запуску.

Сачыце за ходам бегу

Olink выкарыстоўвае NGS у якасці счытвання для колькаснага вызначэння колькасці вядомай паслядоўнасці, каб ацаніць канцэнтрацыю дадзенага бялку ў сampлес (адносна іншых сampлес). Якасць даных з кожнага запуску секвенирования Explore у асноўным вызначаецца параметрамі кантролю якасці, унікальнымі для тэхналогіі Olink. Такім чынам, стандартныя паказчыкі кантролю якасці, якія выкарыстоўваюцца ў звычайным NGS, такія як Q-бал, менш крытычныя.

Гісторыя версій

Версія	Дата	Апісанне
1.2	2022-11-01	1.2 Olink® Mydata заменены на Olink® NPX Explore. 2.4 Дададзена 0.2 N да перад пачаткам.
1.1	2021-12-13	Рэдакцыйныя змены
1.0	2021-12-01	Новы

www.olink.com

Толькі для даследчага выкарыстання. Не для выкарыстання ў дыягнастычных працэдурах.

Гэты прадукт уключае ліцэнзію на некамерцыйнае выкарыстанне прадуктаў Olink. Камерцыйным карыстальнікам могуць спатрэбіцца дадатковыя ліцэнзіі. Калі ласка, звяжыцеся з Olink Proteomics AB для атрымання падрабязнай інфармацыі. Няма ніякіх гарантый, відавочных або пэўных, якія выходзяць за межы гэтага апісання. Olink Proteomics AB не нясе адказнасці за шкоду маёмасці, цялесныя пашкоджанні або эканамічныя страты, выкліканыя гэтым прадуктам. Наступная гандлёвая марка належыць Olink Proteomics AB: Olink®. На гэты прадукт распаўсюджваецца некалькі патэнтаў і патэнтавых заяў, даступных на https://www.olink.com/patents/.

© Аўтарскае права, 2021 Olink Proteomics AB. Усе гандлёвыя маркі трэціх асоб з'яўляюцца ўласнасцю іх адпаведных уладальнікаў.
Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B, SE-752 37 Uppsala, Швецыя
1192, v1.2, 2022-11-01

Дакументы / Рэсурсы

Olink NextSeq 550 Explore Sequencing [pdfКіраўніцтва карыстальніка NextSeq 550 Explore Sequencing, NextSeq 550, Explore Sequencing, Sequencing

Спасылкі

• Кіраўніцтва карыстальніка