Olink NextSeq 2000 Explore Sequence brugermanual

Indhold skjule

1 Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

2 Indledning

3 Laboratorievejledning

4 Revisionshistorie

5 Dokumenter/ressourcer

5.1 Referencer

6 Relaterede indlæg

Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

Dokumentnotat
Olink® Explore-brugermanualen, doc nr. 1153, er forældet og er blevet erstattet af følgende dokumenter:

Olink® Udforsk Overview Brugermanual, doc nr 1187
Olink® Explore 384 brugermanual, doc nr. 1188
Olink® Explore 4 x 384 brugermanual, doc nr. 1189
Olink® Explore 1536 & Expansion User Manual, doc nr. 1190

Olink® Explore 3072 brugermanual, doc nr. 1191
Olink® Udforsk sekvensering ved hjælp af NextSeq 550 brugermanual, doc nr. 1192
Olink® Udforsk sekvensering ved hjælp af NextSeq 2000 brugermanual, doc nr. 1193

Olink® Explore Sequencing ved hjælp af NovaSeq 6000 Brugermanual, doc nr. 1194

Indledning

Tiltænkt brug
Olink® Explore er en multipleks immunanalyseplatform til opdagelse af humane proteinbiomarkører. Produktet er kun beregnet til forskningsbrug og ikke til brug i diagnostiske procedurer. Laboratoriearbejdet må kun udføres af uddannet laboratoriepersonale. Databehandling må kun udføres af uddannet personale. Resultaterne er beregnet til at blive brugt af forskere i forbindelse med andre kliniske eller laboratoriefund.
Om denne manual
Denne brugervejledning indeholder de nødvendige instruktioner til at sekvensere Olink® Explore Libraries på Illumina® NextSeq™ 2000. Instruktionerne skal følges strengt og eksplicit. Eventuelle afvigelser gennem laboratorietrinnene kan resultere i forringede data. Inden du starter laboratoriets arbejdsgang, skal du konsultere Olink® Explore Overview Brugermanual til en introduktion til platformen, inklusive information om reagenser, udstyr og nødvendig dokumentation, en overview af arbejdsgangen, samt laboratorievejledninger. For instruktioner om, hvordan du kører Olink® Explore-reagenssættene, henvises til den relevante Olink® Explore-brugermanual. For databehandling og analyse af Olink® Explore-sekvensresultaterne henvises til Olink® NPX Explore User Manual. Alle varemærker og ophavsrettigheder indeholdt i dette materiale tilhører Olink® Proteomics AB, medmindre andet er angivet.
Teknisk support
For teknisk support, kontakt Olink Proteomics på support@olink.com.

Laboratorievejledning

Dette kapitel indeholder instruktioner om, hvordan du sekvenserer Olink Libraries på NextSeq™ 2000 ved hjælp af NextSeq™ 1000/2000 P2-reagenser (100 cyklusser) v3. Den anvendte protokol til sekventering er en tilpasning af Illumina® standard NGS workflow til Illumina® NextSeq™ 2000.
Før du fortsætter til sekventering, skal du sikre dig, at kvaliteten af det rensede Olink-bibliotek er blevet verificeret. Se den relevante Olink Explore-brugermanual for instruktioner om kvalitetskontrol.
Planlæg sekvenskørslen
Et Olink-bibliotek kan sekventeres pr. NextSeq™ 2000 P2-flowcelle og pr. kørsel. Antallet af P2-flowceller og kørsler, der kræves for at sekvensere de forskellige Olink Explore-reagenssæt, er beskrevet i tabel 1.
Hvis der kræves mere end én kørsel, gentag instruktionerne beskrevet i denne vejledning.
Tabel 1. Planlægning af sekvenskørsel

Olink® Explore Reagent Kit	Antal Olink-biblioteker	Antal flowceller og kørsler
Olink® Explore 384 reagenssæt	1	1
Olink® Explore 4 x 384 reagenssæt	4	4
Olink® Explore 1536 reagenssæt	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 3072 reagenssæt	8	8

Forbered Olink® Custom opskrift
Under dette trin forberedes Olink®-brugeropskriften på NextSeq™ 2000. Dette trin skal kun udføres én gang, før en Olink-sekventeringskørsel udføres for første gang.
Udpak og gem Olink brugerdefinerede opskrift XML-file Olink_NSQ2K_P2_V1 i en passende instrumentmappe.
NOTE: Den brugerdefinerede Olink-opskrift fungerer kun med NextSeq™ 1000/2000 P2-reagenser (100 cyklusser) v3-sættet og NextSeq™ 1000/2000-kontrolsoftwaren v1.2 eller v1.4.

Forbered sekventeringsreagenser
Under dette trin optøs reagenspatronen, der indeholder klynge- og sekventeringsreagenser, og flowcellen forberedes.

ADVARSEL: Reagenspatronen indeholder potentielt farlige kemikalier. Bær passende beskyttelsesudstyr og kasser brugte reagenser i overensstemmelse med gældende standarder. For mere information henvises til Illumina NextSeq 1000 og 2000 System Guide (dokument #1000000109376).

Forbered reagenspatron
Optøning af den uåbnede patron kan ske ved hjælp af tre forskellige metoder: ved stuetemperatur, i et kontrolleret vandbad eller i køleskabet.

Forbered bænk

1x NextSeq™ 1000/2000 P2 reagenspatron (100 cyklusser)

Instruktioner
Optø reagenspatronen som beskrevet i tabel 2.
Tabel 2. Metoder til optøning af reagenspatroner

Optøningsmetode	Instruktioner
Ved stuetemperatur	• Uden at åbne sølvfolieposen skal du placere den frosne reagenspatron på bænken og tø den op ved stuetemperatur i 9 timer. Må ikke overstige 16 timer. • Sørg for, at posens etiket vender opad, og at luft kan cirkulere rundt om patronen.
I et vandbad	• Uden at åbne sølvfolieposen placeres den frosne reagenspatron halvt nedsænket i et kontrolleret 25 °C vandbad og lad den tø op i 6 timer. Må ikke overstige 8 timer. • Sørg for, at posens etiket vender opad, og at patronen ikke vendes under optøning. • Tør patronen grundigt med et papirhåndklæde.
I køleskabet	• Uden at åbne sølvfolieposen, placer patronen på bænken og optø den ved stuetemperatur i 6 timer. • Sørg for, at posens etiket vender opad, og at luft kan cirkulere rundt om patronen. • Afslut optøning af patronen i køleskabet i 12 timer. Overskrid ikke 72 timer. • Før kørslen skal du fjerne den optøede uåbnede patron fra køleskabet og lade den nå stuetemperatur i mindst 15 minutter, men ikke mere end 1 time.

NOTE: Optøede patroner kan ikke genfryses og skal opbevares ved 4 °C i maksimalt 72 timer.

Forbered flowcelle Forbered bænk

1x NextSeq™ 1000/2000 P2 flowcelle

Instruktioner

Bring den afkølede flowcelle til stuetemperatur i 10-15 minutter.

Forbered Olink® Library til sekventering

Under dette trin fortyndes det oprensede og kvalitetskontrollerede Olink Library til den endelige belastningskoncentration. Bemærk, at biblioteksdenaturering udføres automatisk ombord på instrumentet.
Forbered bænk

Lib Tube, forberedt i henhold til den gældende Olink Explore-brugermanual

1x RSB med Tween 20
MilliQ vand
2 x mikrocentrifugerør (1.5 ml)
Manuel pipette (10, 100 og 1000 μL)
Filterpipettespidser

Før du starter

Optø Lib Tube, hvis det er frosset.
Optø den frosne RSB med Tween 20 ved stuetemperatur i 10 minutter. Opbevares ved +4 °C indtil brug.
Marker de to nye 1.5 mL mikrocentrifugerør som følger:
- Marker et rør "Dil" (til 1:100 fortyndet bibliotek)
- Marker et rør "Seq" (for det klar til at indlæse bibliotek)

Instruktioner

Tilsæt 495 μL MilliQ-vand til Dil-røret.

Vortex Lib-røret og drej det kort ned.
Overfør manuelt 5 μL fra Lib Tube til Dil Tube.
Vortex Dil-røret og drej det kort ned.
Tilføj 20 μL RBS med Tween 20 til Seq-røret.

Overfør manuelt 20 μL fra Dil-røret til Seq-røret.
Vortex Seq-røret og drej det kort ned.
Fortsæt med det samme til 2.5. Indlæs flowcelle og Olink®-bibliotek i reagensbeholderen. BEMÆRK: Opbevar Lib-rørene ved -20 °C i tilfælde af potentielle genudsendelser.

Fyld flowcelle og Olink®-bibliotek i reagensbeholderen
Under dette trin fyldes flowcellen og det fortyndede Olink-bibliotek i den optøede reagenspatron.
Forbered bænk

1x optøet NextSeq™ 1000/2000 P2 reagenspatron (100 cyklusser), forberedt i det foregående trin

1x NextSeq™ 1000/2000 P2 Flow Cell, forberedt i det forrige trin
Sex Tube (med klar til at indlæse fortyndet Olink Library), forberedt i det foregående trin

Manuel pipette (100 μL)
Pipettespids (1 ml)

Klargør patronen

Fjern patronen fra sølvfolieposen.
Vend patronen ti gange for at blande de optøede reagenser grundigt indeni.

NOTE: Det er normalt at høre interne komponenter, der klirrer.

Sæt flowcellen i patronen

Når du er klar til at fylde flowcellen i patronen, skal du fjerne flowcellen fra pakken. Hold flowcellen i den grå fane med etiketten på fanen opad. Brug nye pudderfri handsker for at undgå at forurene flowcellens glasoverflade.
Indsæt flowcellen i flowcelleåbningen foran på patronen. Et hørbart klik indikerer, at flowcellen er korrekt placeret.
Fjern den grå tap ved at trække den ud.

Sæt Olink®-biblioteket i patronen

Gennembor biblioteksreservoiret med en ren 1 mL pipettespids.
Indlæs 20 μL af Olink-biblioteket fra Seq-røret i bunden af biblioteksreservoiret.

Udfør Olink®-sekventeringskørsel
Under dette trin indlæses bufferpatronen med den indlæste flowcelle og Olink-biblioteket i NextSeq™ 2000, og sekventeringskørslen startes ved hjælp af Olink-opskriften.
Forbered bænk

1x NextSeq™ 1000/2000 P2-reagenspatron (100 cyklusser) fyldt med NextSeq™ 1000/2000 P2-flowcelle og det fortyndede Olink-bibliotek, forberedt i forrige trin.

Konfigurer Run Mode

Fra kontrolsoftwaremenuen skal du vælge Indstillinger.
Under BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support skal du vælge Local Run Setup.
Vælg Kun proaktiv support som yderligere indstillinger. Denne funktion kræver en internetforbindelse.
Vælg værtsstedet for dine data. Hostingplacering skal være i eller tæt på dit område.
Indstil Output Folder-placeringen for de aktuelle kørende rådata. Vælg Vælg for at navigere og vælg outputmappen.
Marker afkrydsningsfeltet Denaturer og Fortynd om bord for automatisk at denaturere og fortynde biblioteket ombord på instrumentet.
Marker afkrydsningsfeltet Purge Reagent Cartridge for automatisk at rense ubrugte reagenser til det brugte reagenskammer i patronen.
Marker afkrydsningsfeltet Autocheck for softwareopdateringer for automatisk at søge efter softwareopdateringer (valgfrit). Denne funktion kræver en internetforbindelse.
Vælg Gem.

Indstil kørselsparametre

NOTE: Denne instruktion gælder for version 1.4 af NextSeq™ 1000/2000 kontrolsoftwaren. Nogle af trinene beskrevet nedenfor kan være anderledes, når du bruger version v1.2

Fra kontrolsoftwaremenuen skal du vælge Start.
Vælg Manually Set Up New Run og tryk på Setup.
På siden Run Setup skal du konfigurere kørselsparametrene som følger:

Indtast et unikt eksperiment-id i feltet Run Name.
Vælg indstillingen Enkelt læsning på rullelisten Læsetype.

Indtast antallet af cyklusser som følger:

- Læs 1: 24
- Indeks 1: 0
- Indeks 2: 0
- Læs 2: 0

NOTE: Det er afgørende, at Læs 1 er sat til 24, ellers mislykkes hele kørslen.
NOTE: Ignorer advarselsmeddelelserne, når du indtaster antallet af cyklusser.

I rullelisten Custom Primer Wells skal du vælge Nej.
I feltet Brugerdefineret opskrift (valgfrit), skal du vælge Vælg for at navigere og vælge den brugerdefinerede opskrifts XML file Olink_NSQ2K_P2_V1. Vælg Åbn.

Importer ikke en Sample Ark.
Sørg for, at outputmappeplaceringen er korrekt. Ellers skal du vælge Vælg for at navigere og vælge den ønskede outputmappeplacering.
I feltet Denaturer og fortynd ombord skal du vælge Aktiveret fra rullelisten.
Vælg Forbered.

Sæt den fyldte patron i

Vælg Indlæs. Instrumentvisiret åbner, og bakken skydes ud.

Placer den fyldte patron på bakken med etiketten opad og flowcellen inde i instrumentet.
Vælg Luk.
Når patronen er korrekt sat i, skal du kontrollere kørselsparametrene og vælge Sekvens. Instrumentet udfører forudgående kontrol for instrumentet og fluidikken.
NOTE: Under fluidikkontrollen forventes det at høre adskillige knaldende lyde.
Sørg for, at kørslen starter, efter at de automatiske forudgående kontroller er afsluttet (~15 minutter). Køretiden for sekventering er cirka 10h30 min.
NOTE: Se producentens anvisninger for eventuelle fejl i tjek før kørsel.
NOTE: Pas på ikke at støde ind i eller på anden måde forstyrre NextSeq™ 2000 under sekventeringskørslen. Instrumentet er følsomt over for vibrationer.

Rengør arbejdsområdet.

Overvåg kørslens fremskridt
Olink bruger NGS som udlæsning til at kvantificere mængden af en kendt sekvens for at estimere koncentrationen af et givet protein i samples (i forhold til andre samples). Datakvaliteten fra hver Explore-sekventeringskørsel bestemmes hovedsageligt af QC-parametre, der er unikke for Olink-teknologien. Derfor er standardkvalitetskontrolmålinger, der anvendes i konventionelle NGS, såsom Q-score, mindre kritiske.
Skub ud og kassér patronen efter kørslen

ADVARSEL: Dette sæt reagenser indeholder potentielt farlige kemikalier. Bær passende beskyttelsesudstyr og kasser brugte reagenser i overensstemmelse med gældende standarder. For mere information henvises til Illumina NextSeq 1000 og 2000 System Guide (dokument #1000000109376).

Når kørslen er færdig, skal du vælge Eject Cartridge.
NOTE: Den brugte patron inklusive flowcelle kan efterlades på plads indtil næste kørsel, dog ikke mere end 3 dage.

Fjern patronen fra bakken.
Bortskaf reagenserne i overensstemmelse med gældende standarder.
Vælg Luk dør. Bakken lægges i igen.
Vælg Hjem for at vende tilbage til startskærmen.
NOTE: Da patronen indeholder alle mekanismerne til at køre systemet, samt et reservoir til at opsamle brugte reagenser, er der ikke behov for en instrumentvask efter kørslen.

Revisionshistorie

Version	Dato	Beskrivelse
1.1	2022-11-01	1.2 Erstattet Olink® Mydata med Olink® NPX Explore. 2.2 Redigeret.
1.0	2021-12-01	Ny

www.olink.com
Kun til forskningsbrug. Ikke til brug i diagnostiske procedurer.
Dette produkt inkluderer en licens til ikke-kommerciel brug af Olink-produkter. Kommercielle brugere kan kræve yderligere licenser. Kontakt venligst Olink Proteomics AB for detaljer. Der er ingen garantier, udtrykte eller underforståede, som strækker sig ud over denne beskrivelse. Olink Proteomics AB er ikke ansvarlig for ejendomsskade, personskade eller økonomisk tab forårsaget af dette produkt.

Følgende varemærke ejes af Olink Proteomics AB: Olink®.
Dette produkt er dækket af adskillige patenter og patentansøgninger tilgængelige på https://www.olink.com/patents/.