Olink NextSeq 2000 Explore Sequence Användarmanual

Innehåll dölja

1 Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

2 Introduktion

3 Laboratorieinstruktioner

Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

Dokumentanteckning
Olink® Explore användarmanual, doc nr 1153, är föråldrad och har ersatts av följande dokument:

Olink® Explore Overview Användarmanual, doc nr 1187
Olink® Explore 384 användarmanual, doc nr 1188
Olink® Explore 4 x 384 användarmanual, doc nr 1189
Olink® Explore 1536 & Expansion User Manual, doc nr 1190

Olink® Explore 3072 användarmanual, doc nr 1191
Olink® Utforska sekvensering med hjälp av NextSeq 550 användarmanual, doc nr 1192
Olink® Utforska sekvensering med hjälp av NextSeq 2000 användarmanual, doc nr 1193

Olink® Explore Sequencing med NovaSeq 6000 Användarmanual, doc nr 1194

Introduktion

Avsedd användning
Olink® Explore är en multiplex immunanalysplattform för upptäckt av biomarkörer för humant protein. Produkten är endast avsedd för forskningsanvändning och inte för användning i diagnostiska procedurer. Laboratoriearbetet ska endast bedrivas av utbildad laboratoriepersonal. Databehandling ska endast utföras av utbildad personal. Resultaten är avsedda att användas av forskare i samband med andra kliniska eller laboratoriefynd.
Om denna manual
Den här användarhandboken innehåller instruktionerna som behövs för att sekvensera Olink® Explore Libraries på Illumina® NextSeq™ 2000. Instruktionerna måste följas strikt och explicit. Eventuella avvikelser under laboratoriets steg kan resultera i försämrad data. Innan du startar laboratoriets arbetsflöde, konsultera Olink® Explore Overview Användarmanual för en introduktion till plattformen, inklusive information om reagenser, utrustning och nödvändig dokumentation, en överview av arbetsflödet, samt laboratorieriktlinjer. För instruktioner om hur du kör Olink® Explore Reagent Kits, se tillämplig Olink® Explore User Manual. För databearbetning och analys av Olink® Explore-sekvensresultaten, se Olink® NPX Explore User Manual. Alla varumärken och upphovsrätter som finns i detta material tillhör Olink® Proteomics AB, om inte annat anges.
Teknisk support
För teknisk support, kontakta Olink Proteomics på support@olink.com.

Laboratorieinstruktioner

Det här kapitlet innehåller instruktioner om hur du sekvenserar Olink Libraries på NextSeq™ 2000 med hjälp av NextSeq™ 1000/2000 P2-reagenser (100 cykler) v3. Protokollet som används för sekvensering är en anpassning av Illumina® standard NGS arbetsflöde för Illumina® NextSeq™ 2000.
Innan du fortsätter till sekvensering, se till att kvaliteten på det renade Olink-biblioteket har verifierats. Se tillämplig Olink Explore-användarmanual för instruktioner om kvalitetskontroll.
Planera sekvenseringskörningen
Ett Olink-bibliotek kan sekvenseras per NextSeq™ 2000 P2-flödescell och per körning. Antalet P2-flödesceller och körningar som krävs för att sekvensera de olika Olink Explore Reagent Kits beskrivs i Tabell 1.
Om mer än en körning krävs, upprepa instruktionerna som beskrivs i denna manual.
Tabell 1. Sekvenseringskörningsplanering

Olink® Explore Reagent Kit	Antal Olink-bibliotek	Antal flödesceller och körningar
Olink® Explore 384 Reagent Kit	1	1
Olink® Explore 4 x 384 reagenssats	4	4
Olink® Explore 1536 Reagent Kit	4	4
Olink® Explore Expansion Reagent Kit	4	4
Olink® Explore 3072 Reagent Kit	8	8

Förbered Olink® Custom-recept
Under detta steg förbereds det anpassade Olink®-receptet på NextSeq™ 2000. Detta steg behöver bara utföras en gång, innan en Olink-sekvenskörning utförs för första gången.
Packa upp och spara Olinks anpassade recept XML-file Olink_NSQ2K_P2_V1 i en lämplig instrumentmapp.
NOTERA: Olinks anpassade recept fungerar endast med NextSeq™ 1000/2000 P2 Reagents (100 cykler) v3-kit och NextSeq™ 1000/2000 kontrollprogramvara v1.2 eller v1.4.

Förbered sekvenseringsreagenser
Under detta steg tinas reagenspatronen som innehåller klustrings- och sekvenseringsreagenser och flödescellen förbereds.

VARNING: Reagenskassetten innehåller potentiellt farliga kemikalier. Bär adekvat skyddsutrustning och kassera använda reagenser i enlighet med tillämpliga standarder. För mer information, se Illumina NextSeq 1000 och 2000 System Guide (dokument #1000000109376).

Förbered reagenskassetten
Upptining av den oöppnade patronen kan göras med tre olika metoder: i rumstemperatur, i ett kontrollerat vattenbad eller i kylskåpet.

Förbered bänk

1x NextSeq™ 1000/2000 P2 reagenskassett (100 cykler)

Instruktioner
Tina reagenspatronen enligt beskrivningen i Tabell 2.
Tabell 2. Upptiningsmetoder för reagenskassetter

Upptiningsmetod	Instruktioner
Vid rumstemperatur	• Utan att öppna silverfoliepåsen, placera den frysta reagenspatronen på bänken och tina den i rumstemperatur i 9 timmar. Överskrid inte 16 timmar. • Se till att påsens etikett är vänd uppåt och att luft kan cirkulera runt patronen.
I ett vattenbad	• Utan att öppna silverfoliepåsen, placera den frysta reagenspatronen halvt nedsänkt i ett kontrollerat 25 °C vattenbad och låt den tina i 6 timmar. Överskrid inte 8 timmar. • Se till att påsens etikett är vänd uppåt och att patronen inte vänds upp och ner under upptining. • Torka patronen noggrant med en pappershandduk.
I kylen	• Utan att öppna silverfoliepåsen, placera patronen på bänken och tina den i rumstemperatur i 6 timmar. • Se till att påsens etikett är vänd uppåt och att luft kan cirkulera runt patronen. • Avsluta upptining av patronen i kylen i 12 timmar. Överskrid inte 72 timmar. • Före körningen, ta ut den tinade oöppnade patronen ur kylskåpet och låt den nå rumstemperatur under minst 15 minuter, men inte mer än 1 timme.

NOTERA: Upptinade patroner kan inte frysas igen och måste förvaras vid 4 °C, i högst 72 timmar.

Förbered flödescell Förbered bänk

1x NextSeq™ 1000/2000 P2 flödescell

Instruktioner

För den kylda flödescellen till rumstemperatur i 10-15 minuter.

Förbered Olink® Library för sekvensering

Under detta steg späds det renade och kvalitetskontrollerade Olink-biblioteket till den slutliga laddningskoncentrationen. Observera att biblioteksdenaturering utförs automatiskt ombord på instrumentet.
Förbered bänk

Lib Tube, förberedd enligt tillämplig Olink Explore användarmanual

1x RSB med Tween 20
MilliQ vatten
2x mikrocentrifugrör (1.5 ml)
Manuell pipett (10, 100 och 1000 μL)
Filtrera pipettspetsar

Innan du börjar

Tina Lib Tube om den är frusen.
Tina den frysta RSB med Tween 20 i rumstemperatur i 10 minuter. Förvara vid +4 °C fram till användning.
Märk de två nya 1.5 mL mikrocentrifugrören enligt följande:
- Markera ett rör "Dil" (för det 1:100 utspädda biblioteket)
- Markera ett rör "Seq" (för det färdiga att ladda biblioteket)

Instruktioner

Tillsätt 495 μL MilliQ-vatten till Dil-röret.

Vortexa Lib Tube och snurra ner det kort.
Överför manuellt 5 μL från Lib Tube till Dil Tube.
Vortexa Dil Tube och snurra ner den kort.
Tillsätt 20 μL RBS med Tween 20 till Seq Tube.

Överför manuellt 20 μL från Dil-röret till Seq-röret.
Vortexa Seq Tube och snurra ner det kort.
Fortsätt omedelbart till 2.5 Ladda flödescell och Olink®-bibliotek i reagenskassetten. OBS: Förvara Lib-röret/rören vid -20 °C i händelse av potentiella repriser.

Ladda flödescell och Olink® Library i reagenskassetten
Under detta steg laddas flödescellen och det utspädda Olink-biblioteket i den tinade reagenspatronen.
Förbered bänk

1x upptinad NextSeq™ 1000/2000 P2 reagenskassett (100 cykler), förberedd i föregående steg

1x NextSeq™ 1000/2000 P2 flödescell, förberedd i föregående steg
Sex Tube (med färdigt utspädd Olink Library), förberedd i föregående steg

Manuell pipett (100 μL)
Pipettspets (1 ml)

Förbered patronen

Ta bort patronen från silverfoliepåsen.
Vänd på patronen tio gånger för att noggrant blanda de tinade reagenserna inuti.

NOTERA: Det är normalt att höra interna komponenter som klirrar.

Ladda flödescellen i patronen

När du är redo att ladda flödescellen i patronen, ta bort flödescellen från förpackningen. Håll flödescellen i den grå fliken, med etiketten på fliken vänd uppåt. Använd nya puderfria handskar för att undvika att förorena flödescellens glasyta.
Sätt in flödescellen i flödescellskåran framtill på patronen. Ett hörbart klick indikerar att flödescellen är korrekt placerad.
Ta bort den grå fliken genom att dra ut den.

Ladda Olink® Library i patronen

Genomborra biblioteksbehållaren med en ren 1 mL pipettspets.
Ladda 20 μL av Olink-biblioteket från Seq-röret i botten av biblioteksreservoaren.

Utför Olink®-sekvenseringskörning
Under detta steg laddas buffertkassetten med den laddade flödescellen och Olink-biblioteket in i NextSeq™ 2000, och sekvenseringskörningen startas med Olink-receptet.
Förbered bänk

1x NextSeq™ 1000/2000 P2-reagenskassett (100 cykler) laddad med NextSeq™ 1000/2000 P2 Flow Cell och det utspädda Olink-biblioteket, preparerat i föregående steg.

Konfigurera Run Mode

Från kontrollprogramvarumenyn, välj Inställningar.
Under BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support, välj Local Run Setup.
Välj Endast proaktiv support som ytterligare inställningar. Denna funktion kräver en internetanslutning.
Välj värdplats för dina data. Värdplats bör vara i eller nära din region.
Ställ in platsen för utdatamappen för den aktuella körningens rådata. Välj Välj för att navigera och välj utdatamappen.
Markera kryssrutan Denaturera och späd ombord för att automatiskt denaturera och späda ut biblioteket ombord på instrumentet.
Markera kryssrutan Purge Reagent Cartridge för att automatiskt rensa oanvända reagenser till kassettens förbrukade reagensfack.
Markera kryssrutan Autocheck för programuppdateringar för att automatiskt söka efter programuppdateringar (valfritt). Denna funktion kräver en internetanslutning.
Välj Spara.

Ställ in körparametrar

NOTERA: Denna instruktion gäller version 1.4 av NextSeq™ 1000/2000 kontrollprogramvara. Vissa av stegen som beskrivs nedan kan vara annorlunda när du använder version v1.2

Från kontrollprogramvarans meny, välj Start.
Välj Ställ in ny körning manuellt och tryck på Inställningar.
På sidan Run Setup ställer du in körparametrarna enligt följande:

I fältet Körnamn anger du ett unikt experiment-ID.
I listrutan Lästyp väljer du alternativet Enkel läsning.

Ange antalet cykler enligt följande:

- Läs 1: 24
- Index 1: 0
- Index 2: 0
- Läs 2: 0

NOTERA: Det är avgörande att Läs 1 är satt till 24, annars misslyckas hela körningen.
NOTERA: Ignorera varningsmeddelandena när du anger antalet cykler.

I rullgardinsmenyn Custom Primer Wells väljer du Nej.
I fältet Anpassat recept (valfritt), välj Välj för att navigera och välj det anpassade receptets XML file Olink_NSQ2K_P2_V1. Välj Öppna.

Importera inte en Sample Blad.
Se till att platsen för utmatningsmappen är korrekt. Annars väljer du Välj för att navigera och välj önskad plats för utdatamappen.
I fältet Denaturera och späd ombord väljer du Aktiverad från rullgardinsmenyn.
Välj Prep.

Sätt i den laddade patronen

Välj Ladda. Instrumentvisiret öppnas och brickan matas ut.

Placera den laddade patronen på facket med etiketten uppåt och flödescellen inuti instrumentet.
Välj Stäng.
När patronen är korrekt laddad, verifiera körparametrarna och välj Sekvens. Instrumentet utför förkörningskontroller för instrumentet och fluidiken.
NOTERA: Under fluidikkontrollen förväntas den höra flera knäppljud.
Se till att körningen startar efter att de automatiska förkörningskontrollerna har slutförts (~15 minuter). Körtiden för sekvensering är cirka 10h30 min.
NOTERA: Se tillverkarens anvisningar för eventuella fel vid förkörningskontroll.
NOTERA: Var noga med att inte stöta på eller på annat sätt störa NextSeq™ 2000 under sekvenskörningen. Instrumentet är känsligt för vibrationer.

Rengör arbetsområdet.

Övervaka körningsförlopp
Olink använder NGS som en avläsning för att kvantifiera mängden av en känd sekvens för att uppskatta koncentrationen av ett givet protein i samples (i förhållande till andra samples). Datakvaliteten från varje Explore-sekvenskörning bestäms huvudsakligen av QC-parametrar som är unika för Olink-teknik. Därför är standardmätvärden för kvalitetskontroll som används i konventionella NGS, såsom Q-score, mindre kritiska.
Mata ut och kassera patronen efter körningen

VARNING: Denna uppsättning reagenser innehåller potentiellt farliga kemikalier. Bär adekvat skyddsutrustning och kassera använda reagenser i enlighet med tillämpliga standarder. För mer information, se Illumina NextSeq 1000 och 2000 System Guide (dokument #1000000109376).

När körningen är klar, välj Mata ut kassett.
NOTERA: Den använda patronen inklusive flödescell kan lämnas på plats till nästa körning, men inte mer än 3 dagar.

Ta bort patronen från facket.
Kassera reagenserna i enlighet med tillämpliga standarder.
Välj Stäng dörr. Brickan laddas om.
Välj Hem för att återgå till startskärmen.
NOTERA: Eftersom patronen innehåller alla mekanismer för att köra systemet, samt en behållare för att samla upp använda reagenser, finns det inget behov av en instrumenttvätt efter körningen.

Revisionshistorik

Version	Datum	Beskrivning
1.1	2022-11-01	1.2 Ersatte Olink® Mydata med Olink® NPX Explore. 2.2 Redigerat.
1.0	2021-12-01	Ny

www.olink.com
Endast för forskningsanvändning. Ej för användning i diagnostiska procedurer.
Denna produkt inkluderar en licens för icke-kommersiell användning av Olink-produkter. Kommersiella användare kan kräva ytterligare licenser. Kontakta Olink Proteomics AB för detaljer. Det finns inga garantier, uttryckta eller underförstådda, som sträcker sig utöver denna beskrivning. Olink Proteomics AB ansvarar inte för egendomsskador, personskador eller ekonomiska förluster orsakade av denna produkt.

Följande varumärke ägs av Olink Proteomics AB: Olink®.
Denna produkt omfattas av flera patent och patentansökningar tillgängliga på https://www.olink.com/patents/.