Sequência de Exploração Olink NextSeq 2000
Nota do documento
O manual do Utilizador Olink® Explore, doc nº 1153, encontra-se obsoleto, tendo sido substituído pelos seguintes documentos:
- Olink® Explorar Maisview Manual do Utilizador, doc nº 1187
- Olink® Explore 384 User Manual, doc nº 1188
- Olink® Explore 4 x 384 User Manual, doc nº 1189
- Olink® Explore 1536 & Expansion User Manual, doc nr 1190
- Olink® Explore 3072 User Manual, doc nº 1191
- Olink® Explore Sequencing usando NextSeq 550 User Manual, documento nº 1192
- Olink® Explore Sequencing usando NextSeq 2000 User Manual, documento nº 1193
- Olink® Explore Sequencing usando NovaSeq 6000 User Manual, doc nr 1194
Introdução
Uso pretendido
Olink® Explore é uma plataforma de imunoensaio multiplex para descoberta de biomarcadores de proteínas humanas. O produto destina-se apenas para uso em pesquisa e não para uso em procedimentos de diagnóstico. O trabalho de laboratório deve ser executado apenas por pessoal de laboratório treinado. O processamento de dados deve ser realizado apenas por pessoal treinado. Os resultados devem ser usados por pesquisadores em conjunto com outros achados clínicos ou laboratoriais.
Sobre este manual
Este manual do usuário fornece as instruções necessárias para sequenciar as bibliotecas Olink® Explore no Illumina® NextSeq™ 2000. As instruções devem ser rigorosa e explicitamente seguidas. Quaisquer desvios ao longo das etapas do laboratório podem resultar em dados prejudicados. Antes de iniciar o fluxo de trabalho do laboratório, consulte o Olink® Explore Overview Manual do usuário para uma introdução à plataforma, incluindo informações sobre reagentes, equipamentos e documentação necessária, umview do fluxo de trabalho, bem como as diretrizes do laboratório. Para obter instruções sobre como executar os kits de reagentes Olink® Explore, consulte o Manual do usuário Olink® Explore aplicável. Para processamento de dados e análise dos resultados da sequência do Olink® Explore, consulte o Manual do usuário do Olink® NPX Explore. Todas as marcas registradas e direitos autorais contidos neste material são de propriedade da Olink® Proteomics AB, salvo indicação em contrário.
Suporte técnico
Para suporte técnico, entre em contato com a Olink Proteomics em suporte@olink.com.
Instruções de laboratório
Este capítulo fornece instruções sobre como sequenciar bibliotecas Olink no NextSeq™ 2000 usando os reagentes NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos) v3. O protocolo usado para sequenciamento é uma adaptação do fluxo de trabalho NGS padrão Illumina® para Illumina® NextSeq™ 2000.
Antes de proceder ao sequenciamento, certifique-se de que a qualidade da Biblioteca Olink purificada foi verificada. Consulte o Manual do usuário Olink Explore aplicável para obter instruções sobre controle de qualidade.
Planeje a execução do sequenciamento
Uma biblioteca Olink pode ser sequenciada por lâmina de fluxo NextSeq™ 2000 P2 e por execução. O número de células de fluxo P2 e execuções necessárias para sequenciar os diferentes kits de reagentes Olink Explore é descrito na Tabela 1.
Se for necessária mais de uma execução, repita as instruções descritas neste manual.
Tabela 1. Planejamento de execução de sequenciamento
| Kit de reagentes Olink® Explore | Número de bibliotecas Olink | Número de célula(s) de fluxo e corrida(s) |
| Kit de reagentes Olink® Explore 384 | 1 | 1 |
| Kit de reagentes Olink® Explore 4 x 384 | 4 | 4 |
| Kit de reagentes Olink® Explore 1536 | 4 | 4 |
| Kit de reagentes de expansão Olink® Explore | 4 | 4 |
| Kit de reagentes Olink® Explore 3072 | 8 | 8 |
Preparar receita personalizada Olink®
Durante esta etapa, a receita personalizada Olink® é preparada no NextSeq™ 2000. Esta etapa só precisa ser executada uma vez, antes que uma execução de sequenciamento Olink seja realizada pela primeira vez.
Descompacte e salve a receita personalizada Olink XML-file Olink_NSQ2K_P2_V1 em uma pasta de instrumento apropriada.
OBSERVAÇÃO: A receita personalizada Olink funcionará apenas com o kit NextSeq™ 1000/2000 P2 Reagents (100 ciclos) v3 e o software de controle NextSeq™ 1000/2000 v1.2 ou v1.4.
Preparar reagentes de sequenciamento
Durante esta etapa, o cartucho de reagente contendo os reagentes de agrupamento e sequenciamento é descongelado e a célula de fluxo é preparada.
AVISO: O cartucho de reagente contém produtos químicos potencialmente perigosos. Use equipamento de proteção adequado e descarte os reagentes usados de acordo com os padrões aplicáveis. Para obter mais informações, consulte o Guia do sistema Illumina NextSeq 1000 e 2000 (documento nº 1000000109376).
Preparar cartucho de reagente
O descongelamento do cartucho fechado pode ser feito usando três métodos diferentes: em temperatura ambiente, em banho-maria controlado ou na geladeira.
Preparar bancada
- 1 cartucho de reagente NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos)
Instruções
Descongele o cartucho de reagente conforme descrito na Tabela 2.
Tabela 2. Métodos de descongelamento do cartucho de reagente
| Método de descongelamento | Instruções |
| Em temperatura ambiente | • Sem abrir o saco de folha de prata, coloque o cartucho de reagente congelado na bancada e descongele-o à temperatura ambiente durante 9 horas. Não exceda 16 horas.
• Certifique-se de que a etiqueta do saco esteja voltada para cima e que o ar possa circular ao redor do cartucho. |
| Em banho-maria | • Sem abrir o saco de folha de prata, coloque o cartucho de reagente congelado semi-submerso num banho de água controlado a 25 °C e deixe-o descongelar durante 6 horas. Não ultrapasse 8 horas.
• Certifique-se de que a etiqueta do saco esteja voltada para cima e de que o cartucho não se inverta durante o descongelamento. • Seque bem o cartucho com uma toalha de papel. |
| Na geladeira | • Sem abrir a embalagem prateada, coloque o cartucho na bancada e descongele-o em temperatura ambiente por 6 horas.
• Certifique-se de que a etiqueta do saco esteja voltada para cima e que o ar possa circular ao redor do cartucho. • Finalize o descongelamento do cartucho na geladeira por 12 horas. Não exceda 72 horas. • Antes da corrida, retire o cartucho fechado descongelado do refrigerador e deixe-o atingir a temperatura ambiente por pelo menos 15 minutos, mas não mais que 1 hora. |
OBSERVAÇÃO: Os cartuchos descongelados não podem ser recongelados e devem ser armazenados a 4 °C, por um período máximo de 72 horas.
Preparar célula de fluxo Preparar bancada
- 1x célula de fluxo NextSeq™ 1000/2000 P2
Instruções
- Leve a célula de fluxo refrigerada à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos.
Prepare a Biblioteca Olink® para sequenciamento
Durante esta etapa, a Biblioteca Olink purificada e com controle de qualidade é diluída até a concentração de carregamento final. Observe que a desnaturação da biblioteca é executada automaticamente no instrumento.
Preparar bancada
- Lib Tube, preparado de acordo com o Manual do Usuário Olink Explore aplicável
- 1x RSB com Tween 20
- Água MilliQ
- 2 tubos de microcentrífuga (1.5 mL)
- Pipeta manual (10, 100 e 1000 μL)
- Pontas de pipeta com filtro
Antes de começar
- Descongele o Lib Tube se estiver congelado.
- Descongele o RSB congelado com Tween 20 em temperatura ambiente por 10 minutos. Armazene a +4 °C até o uso.
- Marque os dois novos tubos de microcentrífuga de 1.5 mL da seguinte forma:
- Marque um tubo “Dil” (para a Biblioteca diluída 1:100)
- Marque um tubo “Seq” (para a biblioteca pronta para carregar)
Instruções
- Adicione 495 μL de água MilliQ ao Dil Tube.
- Vortex o Lib Tube e gire-o para baixo brevemente.
- Transfira manualmente 5 μL do Lib Tube para o Dil Tube.
- Vortex o Dil Tube e gire-o para baixo brevemente.
- Adicione 20 μL de RBS com Tween 20 ao Seq Tube.
- Transfira manualmente 20 μL do Dil Tube para o Seq Tube.
- Vortex o Seq Tube e gire-o para baixo brevemente.
- Prossiga imediatamente para 2.5 Carregar célula de fluxo e biblioteca Olink® no cartucho de reagente. NOTA: Armazene o(s) Tubo(s) Lib a -20 °C em caso de possível repetição(ões).
Carregue a célula de fluxo e a biblioteca Olink® no cartucho de reagente
Durante esta etapa, a célula de fluxo e a Biblioteca Olink diluída são carregadas no cartucho de reagente descongelado.
Preparar bancada
- 1 cartucho de reagente descongelado NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos), preparado na etapa anterior
- 1x NextSeq™ 1000/2000 P2 Flow Cell, preparada na etapa anterior
- Sex Tube (com biblioteca Olink diluída pronta para carregar), preparado na etapa anterior
- Pipeta manual (100 μL)
- Ponta da pipeta (1 mL)
Prepare o cartucho
- Remova o cartucho da embalagem prateada.
- Inverta o cartucho dez vezes para misturar bem os reagentes descongelados.
OBSERVAÇÃO: É normal ouvir o tilintar dos componentes internos.
Carregue a lâmina de fluxo no cartucho
- Quando estiver pronto para carregar a lâmina de fluxo no cartucho, remova a lâmina de fluxo da embalagem. Segure a lâmina de fluxo pela aba cinza, com a etiqueta na aba voltada para cima. Use novas luvas sem pó para evitar a contaminação da superfície de vidro da célula de fluxo.
- Insira a lâmina de fluxo no slot da lâmina de fluxo na frente do cartucho. Um clique audível indica que a lâmina de fluxo está posicionada corretamente.
- Remova a aba cinza puxando-a para fora.
Carregue a Biblioteca Olink® no cartucho
- Perfure o reservatório da Biblioteca com uma ponta de pipeta limpa de 1 mL.
- Carregue 20 μL da biblioteca Olink do tubo Seq no fundo do reservatório da biblioteca.
Executar o sequenciamento Olink®
Durante esta etapa, o cartucho de buffer com a lâmina de fluxo carregada e a biblioteca Olink é carregado no NextSeq™ 2000 e a execução do sequenciamento é iniciada usando a receita Olink.
Preparar bancada
- 1 cartucho de reagente NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos) carregado com a célula de fluxo NextSeq™ 1000/2000 P2 e a biblioteca Olink diluída, preparada na etapa anterior.
Configurar o modo de execução
- No menu do software de controle, selecione Configurações.
- Em BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support, selecione Local Run Setup.
- Selecione Somente suporte proativo como configurações adicionais. Esta função requer uma conexão com a internet.
- Selecione o local de hospedagem para seus dados. O local de hospedagem deve estar na sua região ou próximo a ela.
- Defina o local da pasta de saída para os dados brutos da execução atual. Selecione Escolher para navegar e selecione a pasta de saída.
- Marque a caixa de seleção Desnaturar e diluir a bordo para desnaturar e diluir automaticamente a biblioteca a bordo do instrumento.
- Marque a caixa de seleção Purge Reagent Cartridge (Purge Reagent Cartridge) para purgar automaticamente os reagentes não utilizados no compartimento de reagentes gastos do cartucho.
- Marque a caixa de seleção Verificação automática de atualizações de software para verificar automaticamente as atualizações de software (opcional). Esta função requer uma conexão com a internet.
- Selecione Salvar.
Configurar parâmetros de execução
OBSERVAÇÃO: Esta instrução se aplica à versão 1.4 do software de controle NextSeq™ 1000/2000. Algumas das etapas descritas abaixo podem ser diferentes ao usar a versão v1.2
- No menu do software de controle, selecione Iniciar.
- Selecione Configurar nova execução manualmente e pressione Configuração.
- Na página Run Setup, configure os parâmetros de execução da seguinte forma:
- No campo Nome da execução, insira um ID de experimento exclusivo.
- Na lista suspensa Tipo de leitura, selecione a opção Leitura única.
Digite o número de ciclos da seguinte forma:
-
- Leia 1: 24
- Índice 1: 0
- Índice 2: 0
- Leia 2: 0
OBSERVAÇÃO: É crucial que Read 1 seja definido como 24, caso contrário, toda a execução falhará.
OBSERVAÇÃO: Ignore as mensagens de aviso ao inserir o número de ciclos.
- Na lista suspensa Custom Primer Wells, selecione No.
- No campo Receita personalizada (opcional), selecione Escolher para navegar e selecione o XML da receita personalizada file Olink_NSQ2K_P2_V1. Selecione Abrir.
- Não importe um Sampo Folha.
- Certifique-se de que o local da pasta de saída esteja correto. Caso contrário, selecione Escolher para navegar e selecione o local da pasta de saída desejada.
- No campo Denature and Dilute Onboard, selecione Enabled na lista suspensa.
- Selecione Preparar.
Carregue o cartucho carregado
- Selecione Carregar. A viseira do instrumento abre e a bandeja é ejetada.
- Coloque o cartucho carregado na bandeja com a etiqueta voltada para cima e a lâmina de fluxo dentro do instrumento.
- Selecione Fechar.
- Depois que o cartucho estiver carregado corretamente, verifique os parâmetros de execução e selecione Sequência. O instrumento executa verificações pré-execução para o instrumento e os fluidos.
OBSERVAÇÃO: Durante a verificação de fluidos, espera-se ouvir vários sons de estalo. - Certifique-se de que a execução comece após a conclusão das verificações automáticas pré-execução (~15 minutos). O tempo de execução do sequenciamento é de aproximadamente 10h30 min.
OBSERVAÇÃO: Para quaisquer falhas de verificação pré-execução, consulte as instruções do fabricante.
OBSERVAÇÃO: Tenha cuidado para não esbarrar ou perturbar o NextSeq™ 2000 durante a execução do sequenciamento. O instrumento é sensível a vibrações. - Limpe a área de trabalho.
Monitorar o progresso da execução
Olink usa NGS como uma leitura para quantificar a quantidade de uma sequência conhecida para estimar a concentração de uma determinada proteína em samples (em relação a outros samples). A qualidade dos dados de cada execução de sequenciamento do Explore é determinada principalmente pelos parâmetros QC exclusivos da tecnologia Olink. Portanto, as métricas de controle de qualidade padrão usadas no NGS convencional, como o Q-score, são menos críticas.
Ejete e descarte o cartucho após a execução
AVISO: Este conjunto de reagentes contém produtos químicos potencialmente perigosos. Use equipamento de proteção adequado e descarte os reagentes usados de acordo com os padrões aplicáveis. Para obter mais informações, consulte o Guia do sistema Illumina NextSeq 1000 e 2000 (documento nº 1000000109376).
- Quando a execução estiver concluída, selecione Ejetar cartucho.
OBSERVAÇÃO: O cartucho usado, incluindo a lâmina de fluxo, pode ser deixado no local até a próxima execução, mas não mais que 3 dias. - Remova o cartucho da bandeja.
- Elimine os reagentes de acordo com as normas aplicáveis.
- Selecione Fechar porta. A bandeja é recarregada.
- Selecione Início para retornar à tela inicial.
OBSERVAÇÃO: Como o cartucho contém todos os mecanismos para executar o sistema, bem como um reservatório para coletar os reagentes usados, não há necessidade de lavar o instrumento após a execução.
Histórico de revisão
| Versão | Data | Descrição |
| 1.1 | 2022-11-01 | 1.2 Substituído Olink® Mydata por Olink® NPX Explore.
2.2 Editado. |
| 1.0 | 2021-12-01 | Novo |
www.olink.com
Apenas para uso em pesquisa. Não deve ser usado em procedimentos de diagnóstico.
Este produto inclui uma licença para uso não comercial dos produtos Olink. Os usuários comerciais podem exigir licenças adicionais. Entre em contato com a Olink Proteomics AB para obter detalhes. Não há garantias, expressas ou implícitas, que se estendam além desta descrição. A Olink Proteomics AB não se responsabiliza por danos materiais, ferimentos pessoais ou perdas econômicas causadas por este produto.
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© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Todas as marcas registradas de terceiros são de propriedade de seus respectivos proprietários. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Suécia 1193, v1.1, 2022-11-01
Documentos / Recursos
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Sequência de Exploração Olink NextSeq 2000 [pdf] Manual do Usuário Sequência de Exploração NextSeq 2000, NextSeq 2000, Sequência de Exploração, Sequência |
