Olink NextSeq 2000 Explore Sequence

Notă de document
Manualul de utilizare Olink® Explore, doc nr. 1153, este învechit și a fost înlocuit cu următoarele documente:

• Olink® Explore Overview Manual de utilizare, doc nr 1187
• Manual de utilizare Olink® Explore 384, doc nr 1188
• Manual de utilizare Olink® Explore 4 x 384, doc nr. 1189
• Olink® Explore 1536 & Expansion User Manual, doc nr 1190
• Manual de utilizare Olink® Explore 3072, doc nr 1191
• Olink® Explore Sequencing folosind NextSeq 550 User Manual, doc nr 1192
• Olink® Explore Sequencing folosind NextSeq 2000 User Manual, doc nr 1193
• Olink® Explore Sequencing folosind NovaSeq 6000 Manual de utilizare, doc nr 1194

Introducere

Utilizare prevăzută
Olink® Explore este o platformă de imunotestare multiplex pentru descoperirea biomarkerilor de proteine ​​umane. Produsul este destinat numai utilizării în cercetare și nu pentru utilizarea în proceduri de diagnosticare. Lucrările de laborator vor fi conduse numai de personalul de laborator instruit. Prelucrarea datelor va fi efectuată numai de personal instruit. Rezultatele sunt menite să fie utilizate de cercetători împreună cu alte constatări clinice sau de laborator.
Despre acest manual
Acest manual de utilizare oferă instrucțiunile necesare pentru a ordona bibliotecile Olink® Explore pe Illumina® NextSeq™ 2000. Instrucțiunile trebuie urmate strict și explicit. Orice abatere de-a lungul etapelor de laborator poate duce la date afectate. Înainte de a începe fluxul de lucru în laborator, consultați Olink® Explore Overview Manual de utilizare pentru o introducere în platformă, inclusiv informații despre reactivi, echipamente și documentația necesară, și pesteview a fluxului de lucru, precum și a ghidurilor de laborator. Pentru instrucțiuni despre cum să rulați kiturile de reactivi Olink® Explore, consultați manualul de utilizare Olink® Explore aplicabil. Pentru procesarea datelor și analiza rezultatelor secvenței Olink® Explore, consultați Manualul utilizatorului Olink® NPX Explore. Toate mărcile comerciale și drepturile de autor conținute în acest material sunt proprietatea Olink® Proteomics AB, dacă nu se specifică altfel.
Suport tehnic
Pentru asistență tehnică, contactați Olink Proteomics la support@olink.com.

Instructiuni de laborator

Acest capitol oferă instrucțiuni despre cum se secvenționează bibliotecile Olink pe NextSeq™ 2000 utilizând reactivii NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 de cicluri) v3. Protocolul utilizat pentru secvențiere este o adaptare a fluxului de lucru standard Illumina® NGS pentru Illumina® NextSeq™ 2000.
Înainte de a trece la secvențiere, asigurați-vă că a fost verificată calitatea bibliotecii Olink purificate. Consultați manualul de utilizare Olink Explore aplicabil pentru instrucțiuni despre controlul calității.
Planificați rularea de secvențiere
O bibliotecă Olink poate fi secvențializată per celulă de flux NextSeq™ 2000 P2 și per ciclu. Numărul de celule de flux P2 și de rulări necesare pentru a secvența diferitele kituri de reactivi Olink Explore este descris în Tabelul 1.
Dacă este necesară mai mult de o rulare, repetați instrucțiunile descrise în acest manual.
Tabelul 1. Planificarea executării secvențelor

Kit de reactivi Olink® Explore	Numărul de biblioteci Olink	Numărul de celule de flux și de rulare
Kit de reactivi Olink® Explore 384	1	1
Kit de reactivi Olink® Explore 4 x 384	4	4
Kit de reactivi Olink® Explore 1536	4	4
Kit de reactivi de expansiune Olink® Explore	4	4
Kit de reactivi Olink® Explore 3072	8	8

Pregătiți rețeta Olink® Custom
În timpul acestui pas, rețeta personalizată Olink® este pregătită pe NextSeq™ 2000. Acest pas trebuie efectuat o singură dată, înainte ca o rulare de secvențiere Olink să fie efectuată pentru prima dată.
Dezarhivați și salvați rețeta personalizată Olink XML-file Olink_NSQ2K_P2_V1 într-un folder de instrument adecvat.
NOTA: Rețeta personalizată Olink va funcționa numai cu kitul NextSeq™ 1000/2000 P2 Reactivs (100 de cicluri) v3 și software-ul de control NextSeq™ 1000/2000 v1.2 sau v1.4.

Pregătiți reactivii de secvențiere
În timpul acestei etape, cartuşul de reactiv care conţine reactivi de grupare şi secvenţiere este dezgheţat şi celula de flux este pregătită.

AVERTIZARE: Cartușul de reactiv conține substanțe chimice potențial periculoase. Purtați echipament de protecție adecvat și aruncați reactivii uzați în conformitate cu standardele aplicabile. Pentru mai multe informații, consultați Ghidul de sistem Illumina NextSeq 1000 și 2000 (documentul #1000000109376).

Pregătiți cartuşul de reactiv
Dezghețarea cartuşului nedeschis se poate face folosind trei metode diferite: la temperatura camerei, într-o baie de apă controlată sau în frigider.

Pregătiți banca

• 1x Cartuș de reactiv NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 de cicluri)

Instrucţiuni
Dezghețați cartușul de reactiv așa cum este descris în Tabelul 2.
Tabel 2. Metode de decongelare a cartuşelor de reactivi

Metoda de decongelare	Instrucţiuni
La temperatura camerei	• Fără a deschide punga din folie argintie, aşezaţi cartuşul de reactiv îngheţat pe bancă şi dezgheţaţi-l la temperatura camerei timp de 9 ore. Nu depășiți 16 ore. • Asiguraţi-vă că eticheta pungii este orientată în sus şi că aerul poate circula în jurul cartuşului.
Într-o baie de apă	• Fără a deschide punga din folie argintie, puneți cartuşul de reactiv congelat pe jumătate scufundat într-o baie de apă controlată la 25 °C și lăsați-l să se dezghețe timp de 6 ore. Nu depășiți 8 ore. • Asiguraţi-vă că eticheta pungii este orientată în sus şi că cartuşul nu se răstoarnă în timpul decongelarii. • Uscaţi bine cartuşul cu un prosop de hârtie.
În frigider	• Fără a deschide punga din folie argintie, așezați cartușul pe bancă și dezghețați-l la temperatura camerei timp de 6 ore. • Asiguraţi-vă că eticheta pungii este orientată în sus şi că aerul poate circula în jurul cartuşului. • Terminați de dezghețat cartuşul în frigider timp de 12 ore. Nu depășiți 72 de ore. • Înainte de alergare, scoateți cartuşul dezghețat nedeschis din frigider și lăsați-l să ajungă la temperatura camerei timp de cel puțin 15 minute, dar nu mai mult de 1 oră.

NOTA: Cartușele decongelate nu pot fi recongelate și trebuie păstrate la 4 °C, timp de maxim 72 de ore.

Pregătiți celula de flux Pregătiți bancul

• 1x Celulă de curgere NextSeq™ 1000/2000 P2

Instrucţiuni

1. Aduceți celula frigorifică la temperatura camerei timp de 10-15 minute.

Pregătiți biblioteca Olink® pentru secvențiere

În timpul acestui pas, biblioteca Olink purificată și controlată de calitate este diluată până la concentrația finală de încărcare. Rețineți că denaturarea bibliotecii se realizează automat la bordul instrumentului.
Pregătiți banca

• Lib Tube, pregătit conform manualului de utilizare Olink Explore aplicabil
• 1x RSB cu Tween 20
• apă MilliQ
• 2x tuburi de microcentrifuga (1.5 ml)
• Pipetă manuală (10, 100 și 1000 μL)
• Vârfurile pipetei cu filtru

Înainte de a începe

• Dezghețați tubul Lib dacă este înghețat.
• Dezghețați RSB congelat cu Tween 20 la temperatura camerei timp de 10 minute. A se păstra la +4 °C până la utilizare.
• Marcați cele două noi tuburi de microcentrifugă de 1.5 ml după cum urmează:
  • Marcați un tub „Dil” (pentru biblioteca diluată 1:100)
  • Marcați un tub „Seq” (pentru biblioteca gata de încărcat)

Instrucţiuni

1. Adăugați 495 μL de apă MilliQ în tubul Dil.
2. Vortexați tubul Lib și rotiți-l pentru scurt timp.
3. Transferați manual 5 μL din tubul Lib în tubul Dil.
4. Vortexați tubul Dil și rotiți-l pentru scurt timp.
5. Adăugați 20 μL de RBS cu Tween 20 în tubul Seq.
6. Transferați manual 20 μL din Tubul Dil în Tubul Seq.
7. Vortexați tubul Seq și rotiți-l pentru scurt timp.
8. Continuați imediat la 2.5 Încărcați celula de flux și biblioteca Olink® în cartuşul de reactiv. NOTĂ: Depozitați tubul(e) Lib la -20 °C în cazul unei potențiale reluări.

Încărcați celula de flux și biblioteca Olink® în cartuşul de reactiv
În timpul acestui pas, celula de flux și biblioteca Olink diluată sunt încărcate în cartuşul de reactiv dezgheţat.
Pregătiți banca

• 1x Cartuș de reactiv NextSeq™ 1000/2000 P2 dezghețat (100 de cicluri), preparat în pasul anterior
• 1x NextSeq™ 1000/2000 P2 Flow Cell, preparată în pasul anterior
• Sex Tube (cu Biblioteca Olink diluată gata de încărcat), pregătit în pasul anterior
• Pipetă manuală (100 μL)
• Vârf pipetă (1 ml)

Pregătiți cartușul

1. Scoateți cartușul din punga de folie argintie.
2. Întoarceți cartuşul de zece ori pentru a amesteca bine reactivii dezghețați.

NOTA: Este normal să auzi componentele interne zgomotând.

Încărcați celula de flux în cartuş

1. Când sunteți gata să încărcați celula de flux în cartuș, scoateți celula de flux din ambalaj. Țineți celula de flux de fila gri, cu eticheta de pe filă în sus. Utilizați mănuși noi fără pudră pentru a evita contaminarea suprafeței de sticlă a celulei de flux.
2. Introduceți celula de flux în fanta celulei de flux din partea din față a cartuşului. Un clic audibil indică faptul că celula de flux este poziționată corect.
3. Scoateți urechea gri trăgând-o afară.

Încărcați biblioteca Olink® în cartuş

1. Perforați rezervorul Library cu un vârf de pipetă curat de 1 ml.
2. Încărcați 20 μL din biblioteca Olink din tubul Seq în partea de jos a rezervorului bibliotecii.

Efectuați o rulare de secvențiere Olink®
În timpul acestui pas, cartuşul tampon cu celula de flux încărcată şi biblioteca Olink este încărcat în NextSeq™ 2000, iar rularea secvenţierii este începută utilizând reţeta Olink.
Pregătiți banca

• 1x Cartuș de reactiv NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 de cicluri) încărcat cu Celula de curgere NextSeq™ 1000/2000 P2 și Biblioteca Olink diluată, preparată în pasul anterior.

Configurați modul Run

1. Din meniul software-ului de control, selectați Setări.
2. Sub BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support, selectați Local Run Setup.
3. Selectați Numai asistență proactivă ca setări suplimentare. Această funcție necesită o conexiune la internet.
4. Selectați locația de găzduire pentru datele dvs. Locația de găzduire ar trebui să fie în sau aproape de regiunea dvs.
5. Setați locația folderului de ieșire pentru datele brute ale rulării curente. Selectați Alegeți pentru a naviga și selectați folderul de ieșire.
6. Bifați caseta de validare Denature and Dilute On Board pentru a denatura și dilua automat biblioteca de la bordul instrumentului.
7. Bifați caseta de selectare Purge Reagent Cartridge pentru a purja automat reactivii neutilizați în compartimentul pentru reactivi uzați al cartuşului.
8. Bifați caseta de selectare Autoverificare pentru actualizări de software pentru a verifica automat actualizările de software (opțional). Această funcție necesită o conexiune la internet.
9. Selectați Salvare.

Configurați parametrii de rulare

NOTA: Această instrucțiune se aplică pentru versiunea 1.4 a software-ului de control NextSeq™ 1000/2000. Unii dintre pașii descriși mai jos pot fi diferiți atunci când utilizați versiunea v1.2

1. Din meniul software-ului de control, selectați Start.
2. Selectați Configurare manuală a unei noi curse și apăsați Configurare.
3. În pagina Run Setup, configurați parametrii de rulare după cum urmează:

• În câmpul Run Name, introduceți un ID unic de experiment.
• În lista drop-down Tip de citire, selectați opțiunea Citire unică.

Introduceți numărul de cicluri după cum urmează:

• • Citeste 1: 24
  • Index 1: 0
  • Index 2: 0
  • Citeste 2: 0

NOTA: Este esențial ca Read 1 să fie setat la 24, altfel întreaga rulare va eșua.
NOTA: Ignorați mesajele de avertizare când introduceți numărul de cicluri.

• În lista derulantă Custom Primer Wells, selectați Nu.
• În câmpul Rețetă personalizată (opțional), selectați Alegeți pentru a naviga și selectați XML rețetă personalizată file Olink_NSQ2K_P2_V1. Selectați Deschidere.
• Nu importați un Sample Sheet.
• Asigurați-vă că locația folderului de ieșire este corectă. În caz contrar, selectați Alegeți pentru a naviga și selectați locația dorită a folderului de ieșire.
• În câmpul Denature and Dilute Onboard, selectați Enabled din lista verticală.
• Selectați Prep.

Încărcați cartuşul încărcat

1. Selectați Încărcare. Vizorul instrumentului se deschide și tava este scoasă.
2. Așezați cartușul încărcat pe tavă cu eticheta în sus și celula de flux în interiorul instrumentului.
3. Selectați Închidere.
4. Odată ce cartuşul este încărcat corect, verificaţi parametrii de rulare şi selectaţi Secvenţă. Instrumentul efectuează verificări înainte de funcționare pentru instrument și fluide.
   NOTA: În timpul verificării fluidice, este de așteptat să audă mai multe sunete de pop.
5. Asigurați-vă că rularea începe după ce au fost finalizate verificările automate înainte de rulare (~15 minute). Durata de rulare a secvenței este de aproximativ 10h30 min.
   NOTA: Pentru orice eșec al verificării înainte de rulare, consultați instrucțiunile producătorului.
   NOTA: Aveți grijă să nu ciocniți sau să perturbați în alt mod NextSeq™ 2000 în timpul rulării secvențierii. Instrumentul este sensibil la vibrații.
6. Curățați zona de lucru.

Monitorizați progresul rulării
Olink folosește NGS ca citire pentru a cuantifica cantitatea unei secvențe cunoscute pentru a estima concentrația unei anumite proteine ​​în samples (în raport cu alte samples). Calitatea datelor de la fiecare rulare de secvențiere Explore este determinată în principal de parametrii QC unici pentru tehnologia Olink. Prin urmare, valorile standard de control al calității utilizate în NGS convenționale, cum ar fi scorul Q, sunt mai puțin critice.
Scoateți și aruncați cartușul după rulare

AVERTIZARE: Acest set de reactivi conține substanțe chimice potențial periculoase. Purtați echipament de protecție adecvat și aruncați reactivii uzați în conformitate cu standardele aplicabile. Pentru mai multe informații, consultați Ghidul de sistem Illumina NextSeq 1000 și 2000 (documentul #1000000109376).

1. Când rularea este completă, selectați Eject Cartridge.
   NOTA: Cartușul folosit, inclusiv celula de flux, poate fi lăsat pe loc până la următoarea rulare, dar nu mai mult de 3 zile.
2. Scoateți cartuşul din tavă.
3. Aruncați reactivii în conformitate cu standardele aplicabile.
4. Selectați Închideți ușa. Tava este reîncărcată.
5. Selectați Acasă pentru a reveni la ecranul de pornire.
   NOTA: Deoarece cartușul conține toate mecanismele pentru a rula sistemul, precum și un rezervor pentru colectarea reactivilor uzați, nu este nevoie de o spălare a instrumentelor după rulare.

Istoricul reviziilor

Versiune	Data	Descriere
1.1	2022-11-01	1.2 S-a înlocuit Olink® Mydata cu Olink® NPX Explore. 2.2 Editat.
1.0	2021-12-01	Nou

www.olink.com
Numai pentru uz de cercetare. Nu este destinat utilizării în procedurile de diagnosticare.
Acest produs include o licență pentru utilizarea necomercială a produselor Olink. Utilizatorii comerciali pot necesita licențe suplimentare. Vă rugăm să contactați Olink Proteomics AB pentru detalii. Nu există garanții, exprese sau implicite, care să se extindă dincolo de această descriere. Olink Proteomics AB nu este responsabil pentru daune materiale, vătămări personale sau pierderi economice cauzate de acest produs.

Următoarea marcă comercială este deținută de Olink Proteomics AB: Olink®.
Acest produs este acoperit de mai multe brevete și cereri de brevet disponibile la https://www.olink.com/patents/.

© Copyright 2021 Olink Proteomics AB. Toate mărcile comerciale ale terților sunt proprietatea deținătorilor respectivi. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Suedia 1193, v1.1, 2022-11-01

Documente/Resurse

Olink NextSeq 2000 Explore Sequence [pdfManual de utilizare NextSeq 2000 Explorați secvența, NextSeq 2000, Explorați secvența, secvența

Referințe

• Manual de utilizare