Secuencia de exploración de Olink NextSeq 2000
Nota del documento
El manual de usuario de Olink® Explore, doc nr 1153, está obsoleto y ha sido reemplazado por los siguientes documentos:
- Explorar con Olink®view Manual de usuario, documento n.º 1187
- Manual de usuario de Olink® Explore 384, documento n.º 1188
- Olink® Explore 4 x 384 Manual de usuario, doc nr 1189
- Olink® Explore 1536 y manual de usuario de expansión, doc nr 1190
- Manual de usuario de Olink® Explore 3072, documento n.º 1191
- Olink® Explore Sequencing usando NextSeq 550 User Manual, doc nr 1192
- Olink® Explore Sequencing usando NextSeq 2000 User Manual, doc nr 1193
- Olink® Explore Sequencing usando NovaSeq 6000 User Manual, doc nr 1194
Introducción
Uso previsto
Olink® Explore es una plataforma de inmunoensayo multiplex para el descubrimiento de biomarcadores de proteínas humanas. El producto está diseñado para uso exclusivo en investigación y no para uso en procedimientos de diagnóstico. El trabajo de laboratorio solo debe ser realizado por personal de laboratorio capacitado. El procesamiento de datos solo debe ser realizado por personal capacitado. Los resultados están destinados a ser utilizados por los investigadores junto con otros hallazgos clínicos o de laboratorio.
Acerca de este manual
Este manual del usuario proporciona las instrucciones necesarias para secuenciar bibliotecas Olink® Explore en Illumina® NextSeq™ 2000. Las instrucciones deben seguirse estricta y explícitamente. Cualquier desviación a lo largo de los pasos del laboratorio puede resultar en datos deteriorados. Antes de iniciar el flujo de trabajo del laboratorio, consulte Olink® Explore Overview Manual de usuario para una introducción a la plataforma, que incluye información sobre los reactivos, el equipo y la documentación necesarios, un resumenview del flujo de trabajo, así como directrices de laboratorio. Para obtener instrucciones sobre cómo ejecutar los kits de reactivos Olink® Explore, consulte el Manual del usuario de Olink® Explore correspondiente. Para el procesamiento de datos y el análisis de los resultados de la secuencia de Olink® Explore, consulte el Manual del usuario de Olink® NPX Explore. Todas las marcas comerciales y derechos de autor contenidos en este material son propiedad de Olink® Proteomics AB, a menos que se indique lo contrario.
Apoyo técnico
Para obtener soporte técnico, comuníquese con Olink Proteomics al soporte@olink.com.
Instrucciones de laboratorio
Este capítulo proporciona instrucciones sobre cómo secuenciar las bibliotecas Olink en NextSeq™ 2000 utilizando los reactivos NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos) v3. El protocolo utilizado para la secuenciación es una adaptación del flujo de trabajo NGS estándar de Illumina® para Illumina® NextSeq™ 2000.
Antes de proceder a la secuenciación, asegúrese de que se haya verificado la calidad de la biblioteca Olink purificada. Consulte el manual de usuario de Olink Explore correspondiente para obtener instrucciones sobre el control de calidad.
Planificar el experimento de secuenciación
Se puede secuenciar una biblioteca Olink por celda de flujo NextSeq™ 2000 P2 y por ejecución. El número de celdas de flujo P2 y ciclos necesarios para secuenciar los diferentes kits de reactivos Olink Explore se describe en la Tabla 1.
Si se requiere más de una ejecución, repita las instrucciones descritas en este manual.
Tabla 1. Planificación del experimento de secuenciación
| Kit de reactivos Olink® Explore | Número de bibliotecas Olink | Número de celdas de flujo y corridas |
| Kit de reactivos Olink® Explore 384 | 1 | 1 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 4 x 384 | 4 | 4 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 1536 | 4 | 4 |
| Kit de reactivos de expansión Explore de Olink® | 4 | 4 |
| Kit de reactivos Olink® Explore 3072 | 8 | 8 |
Preparar receta personalizada Olink®
Durante este paso, la receta personalizada de Olink® se prepara en NextSeq™ 2000. Este paso solo debe realizarse una vez, antes de que se realice una ejecución de secuenciación de Olink por primera vez.
Descomprima y guarde el XML de la receta personalizada de Olink.file Olink_NSQ2K_P2_V1 en una carpeta de instrumentos adecuada.
NOTA: La receta personalizada de Olink solo funcionará con el kit NextSeq™ 1000/2000 P2 Reagents (100 Cycles) v3 y el software de control NextSeq™ 1000/2000 v1.2 o v1.4.
Preparar reactivos de secuenciación
Durante este paso, el cartucho de reactivos que contiene los reactivos de agrupación y secuenciación se descongela y se prepara la celda de flujo.
ADVERTENCIA: El cartucho de reactivo contiene productos químicos potencialmente peligrosos. Use equipo de protección adecuado y deseche los reactivos usados de acuerdo con las normas aplicables. Para obtener más información, consulte la Guía del sistema Illumina NextSeq 1000 y 2000 (n.º de documento 1000000109376).
Preparar cartucho de reactivo
La descongelación del cartucho sin abrir se puede realizar mediante tres métodos diferentes: a temperatura ambiente, en un baño de agua controlado o en el refrigerador.
preparar banco
- 1 cartucho de reactivo NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos)
Instrucciones
Descongele el cartucho de reactivo como se describe en la Tabla 2.
Tabla 2. Métodos de descongelación de cartuchos de reactivos
| método de descongelación | Instrucciones |
| A temperatura ambiente | • Sin abrir la bolsa de aluminio plateado, coloque el cartucho de reactivo congelado en la mesa y descongélelo a temperatura ambiente durante 9 horas. No exceda las 16 horas.
• Asegúrese de que la etiqueta de la bolsa esté hacia arriba y que el aire pueda circular alrededor del cartucho. |
| En un baño de agua | • Sin abrir la bolsa de aluminio plateado, coloque el cartucho de reactivo congelado medio sumergido en un baño de agua controlado a 25 °C y déjelo descongelar durante 6 horas. No exceda las 8 horas.
• Asegúrese de que la etiqueta de la bolsa esté hacia arriba y que el cartucho no se invierta durante la descongelación. • Seque bien el cartucho con una toalla de papel. |
| En el refrigerador | • Sin abrir la bolsa de aluminio plateado, coloque el cartucho en el banco y descongélelo a temperatura ambiente durante 6 horas.
• Asegúrese de que la etiqueta de la bolsa esté hacia arriba y que el aire pueda circular alrededor del cartucho. • Termine de descongelar el cartucho en el refrigerador durante 12 horas. No exceda las 72 horas. • Antes de la ejecución, retire el cartucho sin abrir descongelado del refrigerador y permita que alcance la temperatura ambiente durante al menos 15 minutos, pero no más de 1 hora. |
NOTA: Los cartuchos descongelados no se pueden volver a congelar y deben almacenarse a 4 °C, durante un tiempo máximo de 72 horas.
Preparar la celda de flujo Preparar el banco
- 1 celda de flujo NextSeq™ 1000/2000 P2
Instrucciones
- Lleve la celda de flujo refrigerada a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos.
Preparar la biblioteca Olink® para la secuenciación
Durante este paso, la biblioteca Olink purificada y con control de calidad se diluye hasta la concentración de carga final. Tenga en cuenta que la desnaturalización de la biblioteca se realiza automáticamente a bordo del instrumento.
preparar banco
- Lib Tube, preparado de acuerdo con el manual de usuario de Olink Explore aplicable
- 1x RSB con interpolación 20
- agua MilliQ
- 2 tubos de microcentrífuga (1.5 ml)
- Pipeta manual (10, 100 y 1000 μL)
- Puntas de pipeta con filtro
Antes de empezar
- Descongele el Lib Tube si está congelado.
- Descongele el RSB congelado con Tween 20 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Conservar a +4 °C hasta su uso.
- Marque los dos nuevos tubos de microcentrífuga de 1.5 ml de la siguiente manera:
- Marque un tubo "Dil" (para la biblioteca diluida 1:100)
- Marque un tubo "Seq" (para la biblioteca lista para cargar)
Instrucciones
- Agregue 495 μL de agua MilliQ al tubo Dil.
- Vortex the Lib Tube y gírelo brevemente.
- Transfiera manualmente 5 μL del tubo Lib al tubo Dil.
- Vortex the Dil Tube y gírelo hacia abajo brevemente.
- Agregue 20 μL de RBS con Tween 20 al Seq Tube.
- Transfiera manualmente 20 μL del tubo Dil al tubo Seq.
- Vortex the Seq Tube y gírelo hacia abajo brevemente.
- Continúe inmediatamente con 2.5 Cargue la celda de flujo y la biblioteca Olink® en el cartucho de reactivos. NOTA: Almacene los tubos Lib a -20 °C en caso de posibles repeticiones.
Cargue la celda de flujo y la biblioteca Olink® en el cartucho de reactivo
Durante este paso, la celda de flujo y la biblioteca Olink diluida se cargan en el cartucho de reactivo descongelado.
preparar banco
- 1 cartucho de reactivo Thawed NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos), preparado en el paso anterior
- 1 celda de flujo NextSeq™ 1000/2000 P2, preparada en el paso anterior
- Sex Tube (con Olink Library diluido listo para cargar), preparado en el paso anterior
- Pipeta manual (100 μL)
- Punta de pipeta (1 mL)
Prepara el cartucho
- Retire el cartucho de la bolsa de aluminio plateado.
- Invierta el cartucho diez veces para mezclar bien los reactivos descongelados que contiene.
NOTA: Es normal escuchar el tintineo de los componentes internos.
Cargue la celda de flujo en el cartucho
- Cuando esté listo para cargar la celda de flujo en el cartucho, retire la celda de flujo del paquete. Sujete la celda de flujo por la pestaña gris, con la etiqueta de la pestaña hacia arriba. Utilice guantes nuevos sin talco para evitar contaminar la superficie de vidrio de la celda de flujo.
- Inserte la celda de flujo en la ranura de la celda de flujo en la parte delantera del cartucho. Un clic audible indica que la celda de flujo está colocada correctamente.
- Retire la pestaña gris tirando de ella.
Cargue la biblioteca Olink® en el cartucho
- Perfore el depósito de la biblioteca con una punta de pipeta limpia de 1 ml.
- Cargue 20 μL de la biblioteca Olink del tubo Seq en la parte inferior del depósito de la biblioteca.
Realice el ciclo de secuenciación Olink®
Durante este paso, el cartucho de tampón con la celda de flujo cargada y la biblioteca Olink se cargan en NextSeq™ 2000 y el experimento de secuenciación se inicia con la receta Olink.
preparar banco
- 1 cartucho de reactivo NextSeq™ 1000/2000 P2 (100 ciclos) cargado con la celda de flujo NextSeq™ 1000/2000 P2 y la biblioteca Olink diluida, preparada en el paso anterior.
Configurar el modo de ejecución
- En el menú del software de control, seleccione Configuración.
- En BaseSpace Sequence Hub Services & Proactive Support, seleccione Configuración de ejecución local.
- Seleccione Solo soporte proactivo como configuración adicional. Esta función requiere una conexión a Internet.
- Seleccione la ubicación de alojamiento para sus datos. La ubicación de alojamiento debe estar en su región o cerca de ella.
- Establezca la ubicación de la carpeta de salida para los datos sin procesar de la ejecución actual. Seleccione Elegir para navegar y seleccione la carpeta de salida.
- Seleccione la casilla de verificación Desnaturalizar y diluir a bordo para desnaturalizar y diluir automáticamente la biblioteca a bordo del instrumento.
- Seleccione la casilla de verificación Purgar cartucho de reactivos para purgar automáticamente los reactivos no utilizados en el compartimento de reactivos usados del cartucho.
- Seleccione la casilla de verificación Verificación automática de actualizaciones de software para verificar automáticamente las actualizaciones de software (opcional). Esta función requiere una conexión a Internet.
- Seleccione Guardar.
Configurar parámetros de ejecución
NOTA: Esta instrucción se aplica a la versión 1.4 del software de control NextSeq™ 1000/2000. Algunos de los pasos que se describen a continuación pueden ser diferentes al usar la versión v1.2
- En el menú del software de control, seleccione Iniciar.
- Seleccione Configurar manualmente nueva ejecución y presione Configurar.
- En la página Configuración de ejecución, configure los parámetros de ejecución de la siguiente manera:
- En el campo Nombre de ejecución, ingrese un ID de experimento único.
- En la lista desplegable Tipo de lectura, seleccione la opción Lectura única.
Introduzca el número de ciclos de la siguiente manera:
-
- Leer 1: 24
- Índice 1: 0
- Índice 2: 0
- Leer 2: 0
NOTA: Es crucial que la Lectura 1 esté configurada en 24, de lo contrario, la ejecución completa fallará.
NOTA: Ignore los mensajes de advertencia al ingresar el número de ciclos.
- En la lista desplegable Custom Primer Wells, seleccione No.
- En el campo Receta personalizada (opcional), seleccione Elegir para navegar y seleccione el XML de receta personalizada file Olink_NSQ2K_P2_V1. Seleccione Abrir.
- No importar una Sampla hoja.
- Asegúrese de que la ubicación de la carpeta de salida sea correcta. De lo contrario, seleccione Elegir para navegar y seleccione la ubicación de la carpeta de salida deseada.
- En el campo Desnaturalizar y diluir a bordo, seleccione Habilitado en la lista desplegable.
- Seleccione Preparación.
Cargue el cartucho cargado
- Seleccione Cargar. El visor del instrumento se abre y la bandeja se expulsa.
- Coloque el cartucho cargado en la bandeja con la etiqueta hacia arriba y la celda de flujo dentro del instrumento.
- Seleccione Cerrar.
- Una vez que el cartucho esté correctamente cargado, verifique los parámetros de ejecución y seleccione Secuencia. El instrumento realiza comprobaciones previas a la ejecución del instrumento y la fluídica.
NOTA: Durante la verificación de fluídica, se espera escuchar varios chasquidos. - Asegúrese de que la ejecución comience después de que se hayan completado las comprobaciones automáticas previas a la ejecución (~15 minutos). El tiempo de ejecución de la secuenciación es de aproximadamente 10 h 30 min.
NOTA: Para cualquier falla en la verificación previa a la ejecución, consulte las instrucciones del fabricante.
NOTA: Tenga cuidado de no chocar con el NextSeq™ 2000 ni alterarlo de ningún otro modo durante el experimento de secuenciación. El instrumento es sensible a las vibraciones. - Limpie el área de trabajo.
Supervisar el progreso de la ejecución
Olink usa NGS como una lectura para cuantificar la cantidad de una secuencia conocida para estimar la concentración de una proteína dada en samples (en relación con otros samples). La calidad de los datos de cada ejecución de secuenciación de Explore está determinada principalmente por los parámetros de control de calidad exclusivos de la tecnología Olink. Por lo tanto, las métricas de control de calidad estándar utilizadas en NGS convencionales, como la puntuación Q, son menos críticas.
Expulsar y desechar el cartucho después de la ejecución
ADVERTENCIA: Este conjunto de reactivos contiene productos químicos potencialmente peligrosos. Use equipo de protección adecuado y deseche los reactivos usados de acuerdo con las normas aplicables. Para obtener más información, consulte la Guía del sistema Illumina NextSeq 1000 y 2000 (n.º de documento 1000000109376).
- Cuando finalice la ejecución, seleccione Expulsar cartucho.
NOTA: El cartucho usado, incluida la celda de flujo, puede dejarse en su lugar hasta el próximo análisis, pero no más de 3 días. - Retire el cartucho de la bandeja.
- Deseche los reactivos de acuerdo con las normas aplicables.
- Seleccione Cerrar puerta. La bandeja se vuelve a cargar.
- Seleccione Inicio para volver a la pantalla de inicio.
NOTA: Dado que el cartucho contiene todos los mecanismos para ejecutar el sistema, así como un depósito para recolectar los reactivos usados, no es necesario lavar el instrumento después de la ejecución.
Historial de revisiones
| Versión | Fecha | Descripción |
| 1.1 | 2022-11-01 | 1.2 Se reemplazó Olink® Mydata con Olink® NPX Explore.
2.2 Editado. |
| 1.0 | 2021-12-01 | Nuevo |
www.olink.com
Solo para uso de investigación. No debe utilizarse en los procedimientos de diagnóstico.
Este producto incluye una licencia para el uso no comercial de los productos Olink. Los usuarios comerciales pueden requerir licencias adicionales. Póngase en contacto con Olink Proteomics AB para obtener más detalles. No hay garantías, expresas o implícitas, que se extiendan más allá de esta descripción. Olink Proteomics AB no es responsable de daños a la propiedad, lesiones personales o pérdidas económicas causadas por este producto.
La siguiente marca comercial es propiedad de Olink Proteomics AB: Olink®.
Este producto está cubierto por varias patentes y solicitudes de patente disponibles en https://www.olink.com/patents/.
© Derechos de autor 2021 Olink Proteómica AB. Todas las marcas comerciales de terceros son propiedad de sus respectivos dueños. Olink Proteomics, Dag Hammarskjölds väg 52B , SE-752 37 Uppsala, Suecia 1193, v1.1, 2022-11-01
Documentos / Recursos
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Secuencia de exploración de Olink NextSeq 2000 [pdf] Manual del usuario NextSeq 2000 Secuencia de exploración, NextSeq 2000, Secuencia de exploración, Secuencia |
