ការពង្រឹងគោលដៅជាសកល TELL-Seq

លក្ខណៈ​ពិសេស៖

• ឈ្មោះផលិតផល៖ TELL-SeqTM Target Enrichment
• សម្រាប់៖ ការស្រាវជ្រាវប្រើប្រាស់តែប៉ុណ្ណោះ មិនមែនសម្រាប់ដំណើរការរោគវិនិច្ឆ័យទេ។
• ក្រុមហ៊ុនផលិត: Universal Sequencing Technology Corporation
• DNA ហ្សែនដែលត្រូវការ៖ 5ng
• លក្ខខណ្ឌផ្ទុក៖ Tris buffer pH 7.5-8.0 ឬ TE buffer ទាប

ការណែនាំអំពីការប្រើប្រាស់ផលិតផល

ការណែនាំអំពីការបញ្ចូល DNA ហ្សែន៖
ត្រូវប្រាកដថាអ្នកមានយ៉ាងហោចណាស់ 5ng នៃ DNA ហ្សែនសម្រាប់ពិធីការ។ DNA ទម្ងន់​ម៉ូលេគុល​ខ្ពស់​មាន​សារៈ​សំខាន់​សម្រាប់​ការ​រៀបចំ​លំដាប់​ដោយ​ជោគជ័យ។ កំណត់បរិមាណ DNA ដោយប្រើវិធីសាស្ត្រដែលមានមូលដ្ឋានលើ fluorometric ដូចជា Qubit dsDNA BR Assay Kit ឬ HS Kit ។ រំលាយ DNA ដែលប្រមូលផ្តុំទៅកំហាប់ធ្វើការ (0.4ng/l ទៅ 1ng/l) ក្នុង Tris buffer មុនពេលវាស់។ រក្សាទុក DNA ហ្សែននៅក្នុងបណ្តុំ Tris ជាមួយនឹង pH 7.5-8.0 ឬសតិបណ្ដោះអាសន្ន TE ទាប។

មាតិកាកញ្ចប់៖

កញ្ចប់រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ទំហំស្តង់ដារមានពីរ ប្រអប់៖

• ប្រអប់ទី 1៖ មានផ្ទុកសារធាតុប្រតិកម្មផ្សេងៗ រួមទាំង Barcoding Enzyme, Exonuclease និងច្រើនទៀត។
• ប្រអប់ទី 2៖ មាន TELL Bead Plexb, Wash Solution និង Stop Solution។

ចំណាំ៖ កុំបង្កកនិងរលាយ 1 ប្រអប់ 6 លើសពី XNUMX ដង។

សំណួរគេសួរញឹកញាប់៖

1. សំណួរ: តើខ្ញុំអាចប្រើវិធីសាស្រ្តផ្សេងក្រៅពី fluorometric-based ដើម្បីធ្វើ កំណត់បរិមាណ DNA?
   A: វាត្រូវបានណែនាំអោយប្រើវិធីសាស្ត្រដែលមានមូលដ្ឋានលើ fluorometric ដូចជា Qubit dsDNA BR Assay Kit ឬ HS Kit សម្រាប់ការវាស់វែងត្រឹមត្រូវ។ ជៀសវាងវិធីសាស្រ្តដែលវាស់តែកំហាប់អាស៊ីត nucleic សរុប។
2. សំណួរ៖ តើខ្ញុំគួររក្សាទុក DNA ហ្សែនដោយរបៀបណាដើម្បីទទួលបានលទ្ធផលល្អបំផុត?
   ចម្លើយ៖ DNA ហ្សែនគួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងបណ្តុំ Tris ដែលមាន pH ចាប់ពី 7.5 – 8.0 ឬបណ្តុំ TE ទាប (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) សម្រាប់លទ្ធផលល្អបំផុត។

សម្រាប់ការស្រាវជ្រាវប្រើតែប៉ុណ្ណោះ។ មិនមែនសម្រាប់ប្រើក្នុងនីតិវិធីធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យទេ។
ឯកសារ #100032-USG v4.0
ខែសីហា ឆ្នាំ 2024
ឯកសារនេះមានកម្មសិទ្ធិរបស់ក្រុមហ៊ុន Universal Sequencing Technology Corporation ហើយត្រូវបានបម្រុងទុកសម្រាប់តែការប្រើប្រាស់របស់អតិថិជនរបស់ខ្លួនទាក់ទងនឹងការប្រើប្រាស់ផលិតផលដែលបានពិពណ៌នានៅទីនេះ និងសម្រាប់គោលបំណងផ្សេងទៀតទេ។ ការណែនាំនៅក្នុងឯកសារនេះត្រូវតែអនុវត្តតាមយ៉ាងជាក់លាក់ដោយបុគ្គលិកដែលបានទទួលការបណ្តុះបណ្តាលត្រឹមត្រូវ ដើម្បីធានាបាននូវការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ TELL-Seq™ ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ និងប្រកបដោយសុវត្ថិភាព។
សាជីវកម្មបច្ចេកវិទ្យា SEQUENCING សកលមិនទទួលខុសត្រូវណាមួយដែលកើតឡើងបន្ទាប់ពីការប្រើប្រាស់មិនត្រឹមត្រូវនៃ TELL-SEQ™ KIT។
© 2023 សាជីវកម្មបច្ចេកវិទ្យាលំដាប់សកល។ រក្សាសិទ្ធិគ្រប់យ៉ាង។ TELL-Seq™ គឺជាពាណិជ្ជសញ្ញារបស់ក្រុមហ៊ុន Universal Sequencing Technology Corporation។ ឈ្មោះ ស្លាកសញ្ញា និងពាណិជ្ជសញ្ញាផ្សេងទៀតទាំងអស់ គឺជាកម្មសិទ្ធិរបស់ម្ចាស់រៀងៗខ្លួន។

ប្រវត្តិកែប្រែ

ឯកសារ #100032-USG v1.0	ខែវិច្ឆិកា ឆ្នាំ 2021	ការចេញផ្សាយដំបូង
ឯកសារ #100032-USG v2.0	ខែសីហា ឆ្នាំ 2022	ការធ្វើបច្ចុប្បន្នភាពពិធីការដើម្បីដំណើរការជាមួយ TELL- Seq™ Library Prep kit V1 ដែលបានធ្វើបច្ចុប្បន្នភាពជាមួយនឹងជម្រើស Suspension Buffer EZ និងជម្រើស TELL Bead Plex
Doc #100032-USG v3.0	ខែសីហា ឆ្នាំ 2023	បានលុបជម្រើស TELL Bead។ មានតែ TELL Bead Plex ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់ឆ្ពោះទៅមុខ។ បានបន្ថែមចំណាំ និងរូបភាពជាមួយនឹងប្រព័ន្ធលាយដែលបានណែនាំសម្រាប់ជំហានសំខាន់នៃការបង្វិលបំពង់ត្រឹមត្រូវក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការបាកូដ ដើម្បីរក្សាលក្ខណៈសម្បត្តិ DNA ដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់។
Doc #100032-USG v4.0	ខែសីហា ឆ្នាំ 2024	បានផ្លាស់ប្តូរការណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់សម្រាប់ការពង្រឹងគោលដៅទូទៅ។ បានបន្ថែមព័ត៌មានបន្ថែមអំពីការប្រើ TELL-Seq™ Library Prep ជាមួយនឹងប្រព័ន្ធ Target Enrichment ផ្សេងទៀត។

សេចក្តីផ្តើម

ពិធីសារនេះពន្យល់ពីរបៀបរៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ដែលត្រូវបានបង្កើតជាលិបិក្រមដែលបានពង្រឹងគោលដៅដោយការចាប់យកការបង្កាត់ដោយប្រើការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ TELL-Seq™ Library Prep Kit និង Agilent® SureSelect Target Enrichment System ។ ប្រព័ន្ធ TELL-Seq™ Library Prep Kit ក៏អាចប្រើបានជាមួយប្រព័ន្ធ Target Enrichment ផ្សេងទៀតដូចជា IDT និង Twist Biosciences ផងដែរ។
ឧបករណ៍រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ប្រើប្រាស់បច្ចេកវិទ្យា Transposase Enzyme Linked Long-read Sequencing (TELL-Seq™) ប្រកបដោយភាពច្នៃប្រឌិត† ដើម្បីរៀបចំបណ្ណាល័យដែលភ្ជាប់គ្នាដើម្បីបង្កើតការអានដែលភ្ជាប់បាកូដពីប្រព័ន្ធលំដាប់ Illumina®។ Agilent® SureSelect Target Enrichment System អនុញ្ញាតឱ្យមានការពង្រឹងតំបន់គោលដៅ ដោយប្រើការស៊ើបអង្កេតចាប់យកជាក់លាក់ខ្ពស់។ ប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅនីមួយៗមានបន្ទះស៊ើបអង្កេតតែមួយគត់ដែលអនុញ្ញាតឱ្យចាប់យកតំបន់ជាក់លាក់ដែលត្រូវគ្នាជាមួយបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ។

ការណែនាំអំពីការបញ្ចូល DNA ហ្សែន
5ng DNA ហ្សែនត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ពិធីការនេះ។ ទម្ងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់ (HMW) DNA គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការរៀបចំលំដាប់ TELL-Seq™ ប្រកបដោយជោគជ័យ។

• សម្រាប់ហ្សែនរបស់មនុស្ស អប្បបរមា sampទំហំ DNA គួរតែធំជាង 40Kb។
•  HMW DNA ចាប់ពី 100Kb ដល់ 300Kb គឺជាសម្ភារៈដ៏ល្អបំផុតសម្រាប់កម្មវិធីដំណាក់កាលដ៏ល្អបំផុតរបស់មនុស្ស។
• ជៀសវាងការបំបែក HMW DNA កំឡុងពេលដោះស្រាយ។ យក DNA ទម្ងន់ម៉ូលេគុលទាបចេញ (កំណត់ថាជា smear តិចជាង 10Kb នៅលើជែល) នៅក្នុង sample ប្រសិនបើពួកគេបង្ហាញផ្នែកសំខាន់នៅក្នុង DNA sampលេ

ប្រើវិធីសាស្រ្តដែលមានមូលដ្ឋានលើ fluorometric ដើម្បីកំណត់បរិមាណ DNA បញ្ចូល។ ប្រសិនបើអ្នកប្រើ Qubit dsDNA BR Assay Kit ឬ HS Kit សូមប្រើយ៉ាងហោចណាស់ 2 µL នៃ DNA នីមួយៗampឡេសម្រាប់ការវាស់វែង។ ជៀសវាងវិធីសាស្រ្តដែលវាស់តែកំហាប់អាស៊ីត nucleic សរុប ដូចជា NanoDrop ឬវិធីសាស្ត្រស្រូបកាំរស្មី UV ផ្សេងទៀត។ សម្រាប់ការវាស់វែងត្រឹមត្រូវនៃកំហាប់ HMW DNA ពនឺ DNA ដែលប្រមូលផ្តុំទៅកំហាប់ការងារ (0.4ng/µl ទៅ 1ng/µl) ក្នុង Tris buffer (pH 7.5-8.0) ជាច្រើនម៉ោងទៅមួយថ្ងៃមុនពេលវាស់កំហាប់ និងការរៀបចំបណ្ណាល័យ។ DNA ហ្សែនគួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងបណ្តុំ Tris ដែលមាន pH ចាប់ពី 7.5 ដល់ 8.0 ឬសតិបណ្ដោះអាសន្ន TE ទាប (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)។ សម្រាប់ការវាយតម្លៃភាពបរិសុទ្ធនៃ DNA sampដូច្នេះ សមាមាត្រនៃការវាស់ស្រូបនៅ 260 nm ទៅនឹងការស្រូបនៅ 280 nm អាចត្រូវបានប្រើ។ ពិធីការនេះត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរសម្រាប់ DNA ដែលមានតម្លៃសមាមាត្រស្រូបយក 1.8-2.0 ។ ប្រសិនបើមាន RNA លើសនៅក្នុង DNA sampដូច្នេះ វាគួរតែត្រូវបានយកចេញជាមួយនឹងការព្យាបាល RNase ។

មាតិកាកញ្ចប់

កញ្ចប់រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ទំហំស្តង់ដារ (២ប្រអប់)

ប្រអប់ 1 នៃ 2៖ TELL-Seq™ Library Reagent Box 1 V1 (PN 100035)

ចំណាំ៖ កុំ​បង្កក​និង​រលាយ​សារធាតុ​ក្នុង​ប្រអប់​លេខ​១​លើសពី​៦​ដង​។

a សម្រាប់ប្រើជាមួយ 10× Primer II នៅក្នុង TELL-Seq™ Library Multiplex Primer Kit រួមគ្នាសម្រាប់បណ្ណាល័យ ampការធ្វើត្រាប់តាម។

ប្រអប់ទី 2 នៃ 2៖ TELL-Seq™ Library Reagent Box 2 V1 (PN 100036)

ឈ្មោះសមាសធាតុ	ពណ៌មួក	បរិមាណ (មីលីលីត្រ)	សីតុណ្ហភាពផ្ទុក
ប្រាប់ Bead Plexb	CAP ពណ៌ទឹកក្រូច	76	ពី 2°C ទៅ 8°C
លាងសមាតដំណោះស្រាយ	CAP ពណ៌ស	4500	ពី 2°C ទៅ 8°C
បញ្ឈប់ដំណោះស្រាយc	CAP ធម្មជាតិ	960	ពី 2°C ទៅ 25°C

b TELL Bead Plex ដំណើរការបានល្អទាំងលើប្រព័ន្ធ Illumina និងមិនមែន Illumina Sequencing Systems។
c មុនពេលប្រើ ប្រសិនបើដំណោះស្រាយបញ្ឈប់មិនច្បាស់ ឬមានទឹកភ្លៀងពណ៌ស សូមកំដៅបំពង់ឡើងនៅសីតុណ្ហភាព 37C។ Vortex ដើម្បីរំលាយទឹកភ្លៀងណាមួយ។ បន្ទាប់ពីការប្រើប្រាស់លើកដំបូង សូមទុកដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ដែលបានផ្អាកឡើងវិញនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់សម្រាប់ការប្រើប្រាស់នាពេលអនាគត។

ប្រយ័ត្ន

 TELL-Read pipeline v1.1 ឬខ្ពស់ជាងនេះ គឺតម្រូវឱ្យធ្វើការវិភាគទិន្នន័យលំដាប់លំដោយដែលបង្កើតចេញពីបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ដែលរៀបចំជាមួយ TELL Bead Plex។

កញ្ចប់រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™, HT24 (2 ប្រអប់)
ប្រអប់ទី 1 នៃ 2៖ TELL-Seq™ Library Reagent Box 1 V1, HT24 (PN 100037) 

ចំណាំ៖ កុំ​បង្កក​និង​រលាយ​សារធាតុ​ក្នុង​ប្រអប់​លេខ​១​លើសពី​៦​ដង​។ 

a សម្រាប់ប្រើជាមួយ 10× Primer II នៅក្នុង TELL-Seq™ Library Multiplex Primer Kit រួមគ្នាសម្រាប់បណ្ណាល័យ ampការធ្វើត្រាប់តាម។

ប្រអប់ទី 2 នៃ 2៖ TELL-Seq™ Library Reagent Box 2 V1, HT24 (PN 100038)

ឈ្មោះសមាសធាតុ	ពណ៌មួក		កម្រិតសំឡេង	សីតុណ្ហភាពផ្ទុក
ប្រាប់ Bead Plexb	ពណ៌ទឹកក្រូច		456 មីលីលីត្រ	ពី 2°C ទៅ 8°C
លាងសមាតដំណោះស្រាយ		ខៀវ	28.5 មីលីលីត្រ	ពី 2°C ទៅ 8°C
បញ្ឈប់ដំណោះស្រាយc		ស	5.76 មីលីលីត្រ	ពី 2°C ទៅ 25°C

b TELL Bead Plex ដំណើរការបានល្អទាំងលើប្រព័ន្ធ Illumina និងមិនមែន Illumina Sequencing Systems។
c មុនពេលប្រើ ប្រសិនបើដំណោះស្រាយបញ្ឈប់មិនច្បាស់ ឬមានទឹកភ្លៀងពណ៌ស សូមកំដៅបំពង់ឡើងនៅសីតុណ្ហភាព 37 ºC។ Vortex ដើម្បីរំលាយទឹកភ្លៀងណាមួយ។ បន្ទាប់ពីការប្រើប្រាស់លើកដំបូង សូមទុកដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ដែលបានផ្អាកឡើងវិញនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់សម្រាប់ការប្រើប្រាស់នាពេលអនាគត។

ជំនួយណែនាំ៖ ឧបករណ៍រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ចំនួនពីរ, HT24 រួមទាំងប្រអប់ទី 1 និងប្រអប់ទី 2 អាចផ្គូផ្គងជាមួយឧបករណ៍ប្រើប្រាស់បឋមនៃបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ណាមួយ។

ប្រយ័ត្ន 
TELL-Read pipeline v1.1 ឬខ្ពស់ជាងនេះ គឺតម្រូវឱ្យធ្វើការវិភាគទិន្នន័យលំដាប់លំដោយដែលបង្កើតចេញពីបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ដែលរៀបចំជាមួយ TELL Bead Plex។

TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (1-8) Kit (PN 100003)

PRO TIP៖ មួយ TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (1-8) មាន primer គ្រប់គ្រាន់ដែលត្រូវប្រើជាមួយ FOUR TELL-Seq™ WGS Library Prep Kits។

TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (9-16) Kit (PN 100009)

PRO TIP៖ ONE TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (9-16) Kit មាន primer គ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ប្រើជាមួយ FOUR TELL-Seq™ WGS Library Prep Kits ទំហំស្តង់ដារ។

TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (17-24) Kit (PN 100010)

PRO TIP៖ ONE TELL-Seq™ Library Multiplex Primer (17-24) Kit មាន primer គ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ប្រើជាមួយ FOUR TELL-Seq™ WGS Library Prep Kits ទំហំស្តង់ដារ។

TELL-Seq™ Illumina® Sequencing Primer Kit (PN 100004)

ឈ្មោះសមាសធាតុ	ពណ៌មួក	ការប្រមូលផ្តុំ	បរិមាណ (មីលីលីត្រ)	សីតុណ្ហភាពផ្ទុក
អាន 1 Primer	ខ្មៅ	100mM	50	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

អាន 2 Primer	ស	100mM	50	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C
សន្ទស្សន៍ 1 Primer	ក្រហម	100mM	50	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C
សន្ទស្សន៍ 2 Primer	លឿង	100mM	50	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

TELL-Seq™ Target Blocker (PN 100019)

ឈ្មោះសមាសធាតុ	ពណ៌មួក	បរិមាណ (មីលីលីត្រ)	សីតុណ្ហភាពផ្ទុក
TELL-Seq™ ឧបករណ៍ទប់ស្កាត់គោលដៅ	CAP ពណ៌ស	40	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

សម្ភារៈប្រើប្រាស់ និងបរិក្ខារប្រើប្រាស់ (មិនផ្តល់ជូន)

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

ប្រើប្រាស់បាន។	អ្នកផ្គត់ផ្គង់
0.2 mL បំពង់ PCR ឬបំពង់ឆ្នូត	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
ចុងបំពង់ 20 មីល្លីលីត្រ (ស្តង់ដារនិងច្រកធំទូលាយ)	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
ចុងបំពង់ 200 មីល្លីលីត្រ (ស្តង់ដារនិងច្រកធំទូលាយ)	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
អេតាណុល 200 ភស្តុតាង (ដាច់ខាត) សម្រាប់ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល (500 មីលីលីត្រ)	Sigma-Aldrich, # E7023
ទឹកគ្មានជាតិគីមី	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
AMPយូ XP	Beckman, # A63880
Agilent Bioanalyzer ឧបករណ៍វិភាគ DNA ភាពរសើបខ្ពស់*	Agilent, # 5067-4626
TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay*	Agilent, # 5067-5592, #5067-5593
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, #Q32851 ឬ Q32854
បំពង់តេស្ត Qubit	Thermo Fisher Scientific, #Q32856
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Thermo Fisher Scientific, # 65601, 65602 ឬ 65603
Agilent SureSelect XT HS Capture Library Human All Exon 7	Agilent, # G9704N, G9705N ឬ G9706N
Agilent SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module (Post PCR), 16 Rxn	Agilent, #G9916B
TE buffer, pH 8.0	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ

*អាស្រ័យលើប្រព័ន្ធណាមួយដែលមាននៅក្នុងកន្លែងអ្នកប្រើប្រាស់។

បរិក្ខារ

បរិក្ខារ	អ្នកផ្គត់ផ្គង់
Thermo Cycler	ប្រព័ន្ធជីវសាស្រ្តអនុវត្ត
ជំហរម៉ាញេទិកសម្រាប់បំពង់ PCR 0.2 មីលីលីត្រ	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
ឧបករណ៍បង្វិលបំពង់	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
កន្លែងភ្ញាស់ (សម្រាប់ 35 ° C)	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
Vortexer	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
មីក្រូកណ្តាល	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
ឧបករណ៍វិភាគជីវសាស្ត្រ Agilent *	រហ័សរហួន
Agilent TapeStation*	រហ័សរហួន
Qubit® Fluorometer 3.0	Thermo Fisher Scientific, #Q33216, Q33217 ឬ Q33218
ធុងទឹកកក	អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ
SpeedVac Vacuum Concentrators (ស្រេចចិត្ត)	Thermo Fisher វិទ្យាសាស្រ្ត

*អាស្រ័យលើប្រព័ន្ធណាមួយដែលមាននៅក្នុងកន្លែងអ្នកប្រើប្រាស់។

TELL-Seq™ លំហូរការងារចាប់យក Exome មនុស្ស

ការរៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ WGS

ពិធីការ

ការរៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ WGS
ពិធីការខាងក្រោមពិពណ៌នាអំពីនីតិវិធីរៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ទាំងមូលដែលបានកែប្រែជាមួយនឹងឧបករណ៍រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ដោយប្រើ DNA របស់មនុស្ស។amples ។ DNA ហ្សែនខុសគ្នាampប្រភេទ le ក៏អាចត្រូវបានជំនួសដោយធ្វើតាមពិធីការដូចគ្នា។ បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ អាចប្រើបានជាមួយប្រព័ន្ធ Target Enrichment ផ្សេងទៀត ប៉ុន្តែ Agilent SureSelectXT HS Target Enrichment System ដោយប្រើ SureSelect Human All Exon V8 capture probes ត្រូវបានប្រើជាអតីតample នៅក្នុងពិធីការ។ សម្រាប់ការប្រើប្រាស់នៅក្នុងប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅផ្សេងទៀត សូមអនុវត្តតាមពិធីការសម្រាប់ TELL-Seq™ Library Prep (ទំព័រ 10-22) ដើម្បីបង្កើតបណ្ណាល័យសមស្រប។ បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ អាចត្រូវបានប្រើជាការបញ្ចូល DNA តាមពិធីការនៃប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅជាក់លាក់នីមួយៗ រួមជាមួយនឹងឧបករណ៍ទប់ស្កាត់គោលដៅ TELL-Seq™ ដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់បន្ថែមលើឧបករណ៍ទប់ស្កាត់ដែលបានបញ្ជាក់។

បាកូដ DNA

សម្ភារៈប្រើប្រាស់
➢ បញ្ចូល DNA ហ្សែន (អ្នកប្រើប្រាស់)

ទំហំហ្សែន	ចំនួនទឹកប្រាក់បញ្ចូល	ប្រតិកម្ម Vol (មីលីលីត្រ)	ការត្រៀមរៀបចំ/កញ្ចប់
ធំ (មនុស្ស)	5 ង	150	4

ចំណាំ៖ 

1. DNA ហ្សែនគួរតែត្រូវបានរក្សាទុក និងពនឺក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន Tris ដែលមាន pH ចាប់ពី 7.5 ដល់ 8.0 ឬសតិបណ្ដោះអាសន្ន TE ទាប (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)។

➢ 5 × សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1, ខៀវ)
➢ Cofactor II (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1, Amber)
➢ អង់ស៊ីម Barcoding (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1, ខ្មៅ)
➢ TELL Bead ឬ TELL Bead Plex (ប្រអប់កញ្ចប់ទី 2, ពណ៌ទឹកក្រូច)
➢ Suspension Buffer EZ (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1, ធម្មជាតិ)
➢ ទឹកគ្មានសារធាតុនុយក្លេអ៊ែរ (អ្នកប្រើប្រាស់)
➢ 0.2 mL បំពង់ PCR ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់)
➢20 µL និង 200 µL គន្លឹះបំពង់បង្ហូរតាមមាត់ធំទូលាយ (អ្នកប្រើប្រាស់)

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ
   

   ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
   5 × សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយបន្ទាប់មក   centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   កូហ្វាកទ័រ II	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ រក្សានៅ សីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់ងងឹត។ បិទបំពង់   បិទគម្របឱ្យតឹងបន្ទាប់ពីប្រើនីមួយៗ។
   អង់ស៊ីម Barcoding	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយ។ ចំណុចកណ្តាល យ៉ាងខ្លី។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   ប្រាប់ Bead Plex	ពី 2°C ទៅ 8°C	Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។ បិទគម្របបំពង់  យ៉ាងតឹងរឹងបន្ទាប់ពីការប្រើប្រាស់នីមួយៗ ដើម្បីជៀសវាងការហួត។
   Suspension Buffer EZ	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ រក្សានៅ សីតុណ្ហភាពបន្ទប់.
   ទឹកគ្មានជាតិគីមី	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

2. ដំឡើងឧបករណ៍បង្វិលបំពង់នៅក្នុង incubator 35 ° C (សូមមើលជំហានទី 7 នៃផ្នែកនីតិវិធី) ។

ប្រយ័ត្ន
ប្រើគន្លឹះបំពង់បង្ហូរចេញធំទូលាយដើម្បីផ្ទេរ និងលាយ DNA ហ្សែនដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់ ដើម្បីជៀសវាងការបំបែក DNA ។ ប្រសិនបើ​គន្លឹះ​បំពង់​ទុយោ​ធំ​មិន​អាច​ប្រើ​បាន​ទេ សូម​កាត់​ចុង​បំពង់​ស្តង់ដារ​ពី 2mm-3mm ចេញ​ជាមួយ​នឹង​កាំបិត​ឡាម​ស្អាត​មុន​នឹង​ប្រើ។

នីតិវិធី

1. Vortex TELL Bead Plex យ៉ាងខ្លាំងក្លាយ៉ាងហោចណាស់ 30 វិនាទី។ Pulse spin (centrifuge មិនលើសពី 1 វិនាទី) ដើម្បីទម្លាក់សូលុយស្យុងអង្កាំដែលមាននៅលើគម្រប ឬផ្នែកម្ខាងនៃបំពង់។ មុនពេលប្រើ សូមដាក់បំពង់ TELL Bead Plex ជាមួយនឹងម្ជុល 200 µL ឡើងលើ និងចុះក្រោម 5 ដង ដើម្បីប្រាកដថា អង្កាំទាំងអស់ត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញបានត្រឹមត្រូវ។
2. នៅក្នុងបំពង់ PCR 0.2 mL ប្រមូលផ្តុំប្រតិកម្មនីមួយៗតាមលំដាប់ដូចខាងក្រោម។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម	បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (មីលីលីត្រ)
   	ហ្សែនធំ (150 មីលីលីត្រ)

   5 × សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម	30
   ទឹកគ្មានជាតិគីមី កូហ្វាកទ័រ II	20 – Z (Z គឺជាវ៉ុល DNA)30
   ប្រាប់ Bead Plex (0.5M barcodes/ml)	19

3. លាយ​ឱ្យ​ល្អ​ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​១០​ដង ឬ​បក់​យ៉ាង​ខ្លាំង​រយៈពេល​៥​វិនាទី ហើយ​ជីពចរ​បង្វិល​ដើម្បី​យក​សូលុយស្យុង​ចុះ​មក​បាត។ បន្ថែមអង់ស៊ីម Barcoding ។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម	បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (មីលីលីត្រ)
   	ហ្សែនធំ
   អង់ស៊ីម Barcoding	6 មីលីលីត្រ

4. លាយ​ឱ្យ​សព្វ​ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​ចំនួន ៨ ដង។ ជៀសវាងការណែនាំពពុះខ្យល់នៅពេលដាក់បំពង់ ដោយទុកចុងបំពង់នៅផ្នែកខាងក្រោមនៃដំណោះស្រាយនៅក្នុងបំពង់។
5. ប្រើចុងបំពង់ទុយោធំទូលាយ បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោម។
   ចំណាំ៖ Suspension Buffer EZ មាន viscous ខ្ពស់។ ប្រើការប្រុងប្រយ័ត្ន និងដាក់បំពង់យឺតៗ ដើម្បីធានាថាបរិមាណត្រឹមត្រូវត្រូវបានចែកចាយ។
6. កំណត់បរិមាណ pipette នៅ 110 µL ។ ប្រើ​ចុង​បំពង់​បង្ហូរ​ចេញ​ពី​មាត់​ធំ លាយ​សូលុយស្យុង​ថ្នមៗ ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​យឺតៗ ៦-៨ ដង។ ជៀសវាងការដាក់ពពុះខ្យល់ជាច្រើននៅពេលដាក់បំពង់ ដោយទុកចុងបំពង់នៅផ្នែកខាងក្រោមនៃដំណោះស្រាយនៅក្នុងបំពង់។
7. ដាក់ ​​sample tube នៅលើឧបករណ៍បង្វិលបំពង់ក្នុង incubator 35°C ហើយបង្វិលយឺតៗ (10-15 rpm) រយៈពេល 30 នាទី។

Sample tubes ដាក់នៅលើ Tube Rotator នៅក្នុង incubator 35°C។

ចំណាំ៖ ការបង្វិលបំពង់ត្រឹមត្រូវមានសារៈសំខាន់ណាស់ក្នុងការថែរក្សាលក្ខណៈសម្បត្តិ HMW DNA និងជួយសម្រួលដល់ដំណើរការសរសេរបាកូដត្រឹមត្រូវ។ ប្រព័ន្ធលាយដែលបានណែនាំត្រូវបានបង្ហាញខាងក្រោម (ផ្នែកខាងឆ្វេង)។ ប្រព័ន្ធលាយដែលមិនបង្វិល ឬដែលបង្កើតការញ័រខ្លាំងគឺមិនឆបគ្នាជាមួយនឹងការរក្សាលក្ខណៈសម្បត្តិ HMW DNA និង TELL-Seq; ប្រព័ន្ធមួយចំនួនក៏ត្រូវបានបង្ហាញខាងក្រោម (ផ្នែកខាងស្តាំ)។

ធ្វើឱ្យ DNA មានស្ថេរភាព 

សម្ភារៈប្រើប្រាស់
➢ ឧបករណ៍ទប់លំនឹង (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1, វីយ៉ូឡែត)

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
ឧបករណ៍ទប់លំនឹង	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយ។ Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។

នីតិវិធី

1. ទាញយក sampបំពង់ le ពី incubator 35 ° C ។
2. បន្ថែមស្ថេរភាពទៅក្នុងបំពង់។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម	បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (មីលីលីត្រ)
   	ហ្សែនធំ
   ឧបករណ៍ទប់លំនឹង	3

3. កំណត់បរិមាណ pipette នៅ 110 µL ។ ប្រើ​ចុង​បំពង់​បង្ហូរ​ចេញ​ពី​មាត់​ធំ លាយ​សូលុយស្យុង​ថ្នមៗ​ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​យឺតៗ ៦-៨ ដង។ ជៀសវាងការបង្កើតពពុះច្រើន។
4. ដាក់ ​​sampបើកបំពង់ត្រឡប់មកវិញនៅលើឧបករណ៍បង្វិលបំពង់នៅក្នុង incubator 35 ° C ហើយបង្វិលវាយឺត (10-15 rpm) សម្រាប់ 30 នាទី។

Tagកំណត់ DNA 

សម្ភារៈប្រើប្រាស់
➢ Tagអង់ស៊ីម ging (ប្រអប់កញ្ចប់ 1, ក្រហម)
➢ Exonuclease (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1, លឿង)

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ
   

   ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
   Tagអង់ស៊ីម ging	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយ។ ចំណុចកណ្តាល យ៉ាងខ្លី។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   Exonuclease	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយ។ ចំណុចកណ្តាល យ៉ាងខ្លី។ បន្តនៅលើទឹកកក។

2. ប្រើឧបករណ៍បង្វិលបំពង់ដូចគ្នានៅក្នុង incubator 35 °C។

នីតិវិធី

1. ទាញយក sampបំពង់ le ពី incubator 35 ° C ។
2. បន្ថែម Tagging Enzyme និង Exonuclease ចូលទៅក្នុងបំពង់។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម	បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (មីលីលីត្រ)
   	ហ្សែនធំ
   Tagអង់ស៊ីម ging	2
   Exonuclease	3

3. កំណត់បរិមាណ pipette នៅ 110 µL ។ ប្រើ​ចុង​បំពង់​បង្ហូរ​តាម​រន្ធ​ធំ លាយ​សូលុយស្យុង​ថ្នមៗ​ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​យឺតៗ​ចំនួន 8 ដង។ សម្រាប់ជំហាននេះការលាយត្រូវមានភាពហ្មត់ចត់បំផុត។ ជៀសវាងការបង្កើតពពុះច្រើន។
4. ដាក់ ​​sample tube ត្រលប់មកវិញនៅលើឧបករណ៍បង្វិលបំពង់ក្នុង incubator 35°C ហើយបង្វិលវាយឺតៗរយៈពេល 10 នាទី។ នៅពេលចាំបាច់បរិមាណខុសគ្នា Tagging Enzyme អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកែតម្រូវទំហំបណ្ណាល័យ។
   ចំណាំ៖ ប្រសិន​បើ​បណ្ណាល័យ​បញ្ចូល​យូរ​ជាង​ត្រូវ​បាន​ពេញ​ចិត្ត នោះ​ចំនួន​តិច​ជាង Tagging Enzyme អាចត្រូវបានប្រើក្នុងប្រតិកម្ម។ ម្យ៉ាងវិញទៀត ប្រសិនបើបណ្ណាល័យបញ្ចូលខ្លីជាងត្រូវបានគេពេញចិត្ត នោះរហូតដល់ 6µL Tagging Enzymes អាចត្រូវបានប្រើក្នុងប្រតិកម្ម។
5. បន្តទៅជំហានបន្ទាប់ភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការ incubation ។

លាងសមាតអង្កាំ

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• ដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ (ប្រអប់កញ្ចប់ទី 2, ធម្មជាតិ ឬរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ បន្ទាប់ពីប្រើលើកដំបូង)
• ដំណោះស្រាយលាងសម្អាត (ប្រអប់កញ្ចប់ទី 2, ស)
• 0.2 mL បំពង់ PCR ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់)

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ
   

   ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
   បញ្ឈប់ដំណោះស្រាយ	ពី 2°C ទៅ 25°C	ពិនិត្យរកទឹកភ្លៀងណាមួយ។ ប្រសិនបើមានវត្តមាន ចូរភ្ញាស់សតិបណ្ដោះអាសន្ននៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 10 នាទី ហើយ vortex រហូតដល់វារលាយ។ ទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ សម្រាប់  ការប្រើប្រាស់នាពេលអនាគត។
   លាងសមាតដំណោះស្រាយ	ពី 2°C ទៅ 8°C	នាំយកទៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

2. ដំឡើង​ម៉ាស៊ីន​កម្តៅ​ជាមួយ​កម្មវិធី​ខាងក្រោម៖
   • កំដៅជម្រើសគម្របទៅ 100 ° C
   • 63°C ជារៀងរហូត

នីតិវិធី

1. ដាក់ ​​sample tube នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
2. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នា ហើយបោះចោលវត្ថុដ៏អស្ចារ្យដោយមិនមានការរំខាន។
3. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់ម៉ាញេទិក។ បន្ថែម 120 µL ដំណោះស្រាយលាងសម្អាតទៅ sampបំពង់។ បំពង់ដើម្បីព្យួរអង្កាំ។ បើចាំបាច់ ជីពចរបង្វិលដើម្បីយកដំណោះស្រាយចុះ។
4. ដាក់ ​​sample tube ត្រលប់មកវិញនៅលើជំហរម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
5. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នា ហើយបោះចោលវត្ថុដ៏អស្ចារ្យដោយមិនមានការរំខាន។
6. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់ម៉ាញេទិក។ បន្ថែម 80 µL នៃដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ទៅក្នុងបំពង់។
7. Pipet ជាច្រើនដងដើម្បីព្យួរអង្កាំឡើងវិញ។ បើចាំបាច់ ជីពចរបង្វិលដើម្បីយកដំណោះស្រាយចុះ។
8. ដាក់បំពង់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 5 នាទី។
9. ដាក់ ​​sample tube ត្រលប់មកវិញនៅលើជំហរម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
10. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នា ហើយបោះចោលវត្ថុដ៏អស្ចារ្យដោយមិនមានការរំខាន។
11. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់ម៉ាញេទិក។ បន្ថែមដំណោះស្រាយលាងសម្អាត 120 µL ទៅបំពង់ PCR ។ បំពង់ដើម្បីព្យួរអង្កាំ។
12. ផ្ទេរដំណោះស្រាយអង្កាំទាំងអស់ទៅក្នុងបំពង់ PCR ថ្មី 0.2ml ។
13. ដាក់បំពង់នៅសីតុណ្ហភាព 63 អង្សាសេនៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ PCR រយៈពេល 3 នាទី។
14. ដាក់ ​​s ថ្មី។ample tube នៅលើម៉ាញេទិកឈរនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
15. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នា ហើយបោះចោលវត្ថុដ៏អស្ចារ្យដោយមិនមានការរំខាន។
16. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់ម៉ាញេទិក។ បន្ថែមដំណោះស្រាយលាងសម្អាត 120 µL ទៅបំពង់ PCR ។ បំពង់ដើម្បីព្យួរអង្កាំ។ បើចាំបាច់ ជីពចរបង្វិលដើម្បីយកដំណោះស្រាយចុះ។
17. ដាក់បំពង់នៅសីតុណ្ហភាព 63 អង្សាសេនៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ PCR រយៈពេល 3 នាទី។
18. ដាក់ ​​sample tube នៅលើម៉ាញេទិកឈរនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
19. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នា ហើយបោះចោលវត្ថុដ៏អស្ចារ្យដោយមិនមានការរំខាន។ ប្រើបំពង់ P20 ដើម្បីលុបអតិសុខុមប្រាណដែលនៅសេសសល់។
20. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់ម៉ាញេទិក។ ផ្អាកអង្កាំម្តងទៀតក្នុង 20 µL នៃដំណោះស្រាយលាងសម្អាត។

ចំណាំ
នេះ​ជា​ចំណុច​ឈប់​ដោយ​សុវត្ថិភាព។ អង្កាំដែលលាងសម្អាតអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 2°C ទៅ 8°C រយៈពេលពីរសប្តាហ៍។

Amplify បណ្ណាល័យ

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• 2 × PCR Master Mix (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1, ពណ៌ផ្កាឈូក)
• 10 × Primer I (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1,  ស)
• 10 × Primer II, T50# (កញ្ចប់ថ្នាំ primer ច្រើន)
• ទឹកគ្មានជាតិគីមី (អ្នកប្រើប្រាស់)
• 0.2 mL បំពង់ PCR ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់)

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ
   

   ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
   2 × PCR Master Mix	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5  ដងដើម្បីលាយបន្ទាប់មក centrifuge ខ្លី។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   10 × Primer I	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយបន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   10 × Primer II, T50#	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយបន្ទាប់មក  centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   ឧបករណ៍ពង្រឹង	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយបន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
   ទឹកគ្មានជាតិគីមី	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

2. រៀបចំបណ្ណាល័យ Ampកម្មវិធី lification (LAP) លើម៉ាស៊ីនកម្តៅទឹកដូចខាងក្រោម៖
   • 63°C 2 នាទី។
   • 72°C 2 នាទី។
   • 98°C 30 វិនាទី
   • [98°C 15 វិនាទី, 63°C 20 វិនាទី, 72°C 30 វិនាទី] x លេខវដ្ត
   • 72°C 3 នាទី។
   • 4°C ជារៀងរហូត

ចំណាំ៖
លេខវដ្តអាចបត់បែនបានដោយផ្អែកលើកម្មវិធី និងតម្រូវការ។ សូមផ្តល់អនុសាសន៍ចាប់ផ្តើមជាមួយនឹង 13 វដ្ត។ លេខវដ្តខ្ពស់នឹងបង្កើតបណ្ណាល័យ TELL-Seq បន្ថែមទៀតដែលជាធាតុបញ្ចូលសម្រាប់ Hybridization និង Capture ប៉ុន្តែអត្រាស្ទួនខ្ពស់ជាងសម្រាប់ការវិភាគលំដាប់ចុងក្រោយ។ ចំនួនវដ្តទាបអាចបន្ថយអត្រាចម្លង ប៉ុន្តែការបញ្ចូល DNA ទាបអាចបណ្តាលឱ្យថយចុះប្រសិទ្ធភាពនៃការចាប់យក និងកាត់បន្ថយភាពស្មុគស្មាញបណ្ណាល័យ។ សូមយោងទៅចុងបញ្ចប់នៃ Qualify and Quantify Library for Hybridization and Capture សម្រាប់ការពិចារណាបន្ថែមនៅពេលកំណត់ចំនួនវដ្តសមស្រប។

ទំហំហ្សែន	វ៉ុលនៃអង្កាំដែលប្រើ (ខ) សម្រាប់ PCR	បរិមាណ PCR	លេខវដ្ត
ធំ	20 មីលីលីត្រ	75 មីលីលីត្រ	០១៤៨៦០៧៤-០០៤

នីតិវិធី

1. អង្កាំ Vortex យ៉ាងខ្លាំងក្លារយៈពេល 10 វិនាទី ដើម្បីផ្អាកអង្កាំឡើងវិញ។ ជីពចរបង្វិលដើម្បីនាំយកដំណោះស្រាយចុះក្រោម។ ដោយប្រើព័ត៌មានជំនួយ 20 µL បំពង់អង្កាំឡើងលើ និងចុះក្រោម 5 ដង ដើម្បីប្រាកដថា អង្កាំទាំងអស់ត្រូវបានព្យួរឡើងវិញបានត្រឹមត្រូវ។ ផ្ទេរបរិមាណសូលុយស្យុងអង្កាំទាំងមូលទៅបំពង់ PCR ថ្មី។
2. ដាក់បំពង់ PCR នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទី ឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
3. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក យក 20 µ L លើសចំណុះ ដោយគ្មានអង្កាំរំខាន។ ដកបំពង់ PCR ចេញពីមេដែក។
4. បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោមទៅបំពង់ PCR ។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម	បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (µL)
   	ហ្សែនធំ (75 μL)
   ទឹកគ្មានជាតិគីមី	16 មីលីលីត្រ
   2 × PCR Master Mix	37.5 មីលីលីត្រ
   10 × Primer I	7.5 មីលីលីត្រ
   10 × Primer II, T50#	7.5 មីលីលីត្រ
   ឧបករណ៍ពង្រឹង បៃតង	4.5 មីលីលីត្រ

5. លាយល្អដោយ vortexing ឬ pipeting ។ ជីពចរបង្វិលដើម្បីនាំយកដំណោះស្រាយចុះក្រោម។
6. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ ហើយដំណើរការកម្មវិធី LAP (សូមមើលខាងលើ) ជាមួយនឹងចំនួនវដ្តត្រឹមត្រូវ។
7. បន្ទាប់ពី PCR amplification ប្រើផលិតផល 2 µL PCR សម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យគុណភាពនៅលើ Bioanalyzer ឬ TapeStation ។ សូមមើលផ្នែក Qualify and Quantify Library សម្រាប់ការណែនាំ។

ជំនួយណែនាំ៖ ប្រសិនបើការត្រួតពិនិត្យ QC បង្ហាញថាទិន្នផលបណ្ណាល័យមានកម្រិតទាប សូមដាក់បំពង់ជាមួយនឹងផលិតផល PCR ដែលនៅសល់ត្រឡប់ទៅម៉ាស៊ីនកម្តៅ និង ampកំណត់សម្រាប់វដ្តបន្ថែមមួយ ឬពីរផ្សេងទៀត មុនពេលផ្លាស់ទីទៅផ្នែកសម្អាតបណ្ណាល័យ។

ចំណាំ៖
នេះ​ជា​ចំណុច​ឈប់​ដោយ​សុវត្ថិភាព។ ផលិតផល PCR អាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -25 ° C ទៅ -15 ° C សម្រាប់រយៈពេលមួយខែ។

សម្អាតបណ្ណាល័យ

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• AMPure XP (អ្នកប្រើប្រាស់)
• ភស្តុតាងអេតាណុល 200 (ដាច់ខាត) សម្រាប់ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល (អ្នកប្រើប្រាស់)
• ទឹកគ្មានជាតិគីមី (អ្នកប្រើប្រាស់)
• 0.2 mL បំពង់ PCR ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់)

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
អេតាណុលស្រស់ 75% (v/v)	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	ត្រូវការ 400 មីលីលីត្រក្នុងមួយវិនាទីampលេ លាយ 1.5 mL អេតាណុល (200 ភស្តុតាង) ជាមួយ 0.5 mL ទឹកគ្មាននុយក្លេអ៊ែ។ Vortex ដើម្បីលាយនិងរក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
AMPយូ XP	ពី 2°C ទៅ 8°C	យកវាទៅសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់យ៉ាងហោចណាស់ 20 នាទី ហើយកូរឱ្យខ្លាំង ដើម្បីផ្អាកអង្កាំមុនពេលប្រើ។
ទឹកគ្មានជាតិគីមី	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
TE buffer, pH 8.0	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

នីតិវិធី

1. ដោយសង្ខេប centrifuge sampបំពង់ PCR ដើម្បីនាំយកដំណោះស្រាយទាំងអស់ចុះក្រោម។
2. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
3. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើទីតាំងម៉ាញេទិក ផ្ទេរ supernatant ទៅបំពង់ PCR ថ្មី 0.2 mL ដោយគ្មានអង្កាំរំខាន។
4. វាស់បរិមាណនៃ supernatant ផ្ទេរ (ផលិតផល PCR) ជាមួយ pipette ។
5. បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោមទៅក្នុងផលិតផល PCR ទៅក្នុងបរិមាណសរុប 100 μL។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម	បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម
   ផលិតផល PCR	75 មីលីលីត្រ
   ទឹកគ្មានជាតិគីមី	សរុបទៅ 100 មីលីលីត្រ

6. Vortex យ៉ាងខ្លាំងក្លាដើម្បីផ្អាកដំណើរការឡើងវិញ AMPដំណោះស្រាយ ure XP និងបន្ថែម 78 μL AMPure XP ទៅក្នុងផលិតផល PCR 100 µL ។
7. លាយដោយបំពង់ឡើងលើចុះក្រោម 10 ដង។
8. ដុតនំនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 5 នាទី។
9. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
10. ប្រាថ្នា​ហើយ​បោះចោល​អតិរេក​ដោយ​គ្មាន​ការ​រំខាន AMPអង្កាំអ៊ុយ។
11. ខណៈពេលដែលរក្សាបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិក បន្ថែម 200 µL អេតាណុល 75% ដែលបានរៀបចំថ្មីៗទៅក្នុងបំពង់។ ទុកឱ្យវាអង្គុយរយៈពេល 30 វិនាទី។
12. ប្រាថ្នា​ហើយ​បោះចោល​អណ្តែត​ដោយ​គ្មាន​អង្កាំ​រំខាន។
13. ធ្វើជំហានទី 11-12 ម្ដងទៀត ដោយរក្សាបំពង់នៅលើទីតាំងម៉ាញេទិកពេញមួយពេល។
14. ទុកបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិកដោយបើកគម្រប ហើយទុកឱ្យបំពង់ស្ងួតរយៈពេល 1-2 នាទី ដើម្បីហួតដានអេតាណុល។ កុំស្ងួតអង្កាំពេក។
15. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់ម៉ាញេទិក ហើយបន្ថែមទឹកដែលគ្មានជាតិ 20 µL ទៅក្នុងអង្កាំ។
16. Pipette ឬ vortex ដើម្បីផ្អាកអង្កាំ។ ទុកឱ្យវាអង្គុយរយៈពេល 5 នាទី។
17. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
18. យកមកវិញនូវ 18 µL នៃ supernatant ទៅបំពង់ថ្មីមួយ។ ប្រយ័ត្នកុំរំខានអង្កាំ។
19. supernatant មានបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ។

ចំណាំ៖
នេះ​ជា​ចំណុច​ឈប់​ដោយ​សុវត្ថិភាព។ បណ្ណាល័យ TELL-Seq ដែលត្រូវបានបន្សុតអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25°C ដល់ -15°C រយៈពេលមួយខែ។

គុណភាព និងបរិមាណបណ្ណាល័យសម្រាប់ការពង្រឹងគោលដៅ

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• Agilent High Sensitivity DNA Kit ឬ TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay (អ្នកប្រើប្រាស់)
• Qubit dsDNA HS Assay Kit (អ្នកប្រើប្រាស់)
• TE buffer, pH 8.0 (អ្នកប្រើប្រាស់)

ចំណាំ៖
ការវិភាគបរិមាណបណ្ណាល័យ qPCR ស្តង់ដារសម្រាប់ប្រព័ន្ធ Illumina ដំណើរការសម្រាប់បណ្ណាល័យ TELL-Seq ប៉ុន្តែវាមិនត្រូវបានទាមទារទេ។

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ចាំបាច់តាមតម្រូវការរបស់ Bioanalyzer ឬ TapeStation និង Qubit ។

នីតិវិធី

1. ប្រើបណ្ណាល័យ 1 µL សម្រាប់ Agilent High Sensitivity DNA Kit ឬ 2 µL នៃបណ្ណាល័យសម្រាប់ TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay ។
2. ពិនិត្យផលិតផល PCR ដែលមិនស្អាតដែលបានរក្សាទុកពី Amplify ផ្នែកបណ្ណាល័យក្នុងពេលតែមួយ។ ផលិតផល PCR ដែលមិនបានសម្អាតអាចមានកម្រិតខ្ពស់នៃ primer dimer និងអាដាប់ទ័រ dimer ។ វាតម្រូវឱ្យមានការពនលាយពីរដងជាមួយនឹងទឹកដែលមិនមានសារធាតុនុយក្លេអ៊ែរ មុនពេលផ្ទុកនៅលើបន្ទះឈីប Bioanalyzer ឬកាសែត TapeStation ដើម្បីជៀសវាងការរំខានដល់សញ្ញាសម្គាល់ទាបជាង។
3. បណ្ណាល័យដែលមានទំហំល្អគួរមានបំណែកបណ្ណាល័យភាគច្រើនក្រោម 1000 bp (រូបភាពទី 1)។រូបភាពទី 1. ឧample of cleaned up library profile ពី TapeStation High Sensitivity D5000 Screen Tape assay ។
4. បណ្ណាល័យអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25 ° C ទៅ -15 ° C ។
5. បង្កើតបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ដែលត្រូវបានពនលាយ 10 ដងample: ពនឺ 2 µL នៃបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ជាមួយនឹង 18 µL នៃទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអ៊ែ។ ប្រើបណ្ណាល័យលាយ 4 µL ដើម្បីពិនិត្យមើលការផ្តោតអារម្មណ៍ជាមួយ Qubit dsDNA HS Assay Kit ។
6. ប្រើកំហាប់ (ng/µL) និងបរិមាណដើម្បីគណនាម៉ាស់សរុបនៃបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ នីមួយៗដែលចូលទៅក្នុងដំណើរការប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅ SureSelectXT HS ។ 500 ng -1,000 ng បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ក្នុងមួយវិនាទីample ត្រូវបានណែនាំសម្រាប់លទ្ធផលដ៏ល្អប្រសើរ ប៉ុន្តែការបញ្ចូលក្នុងបណ្ណាល័យមានកម្រិតទាបរហូតដល់ 250 ng ក្នុងមួយវិនាទីample គឺអាចធ្វើទៅបាន ទោះបីជាការអនុវត្តអាចរងផលប៉ះពាល់អវិជ្ជមានក៏ដោយ។
   ចំណាំ៖
   មានកម្រិតសំឡេងសម្រាប់ពិធីការ Hybridization និង Capture ។ 12 µL គឺជាបរិមាណអតិបរមាដែលអនុញ្ញាតសម្រាប់ការបញ្ចូល DNA ។ ការពិចារណាដោយប្រុងប្រយ័ត្នគួរតែត្រូវបានប្រើដើម្បីធានាថាបរិមាណបណ្ណាល័យ DNA ធ្លាក់ក្នុងជួរនេះ។ តាមឧត្ដមគតិប្រើសម្ភារៈបណ្ណាល័យ TELL-Seq ដែលមានទាំងអស់បន្ទាប់ពី QC ចូលទៅក្នុងប្រតិកម្ម Hybridization និង Capture ។
7. (ជាជម្រើស) បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ អាចត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដោយប្រើ SpeedVac Vacuum Concentrator ។ ប្រសិនបើ SpeedVac នឹងត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំបណ្ណាល័យ បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ បន្ទាប់ពី AMPការសម្អាត ure XP អាចត្រូវបានដកចេញពីអងា្កំ XP ជាមួយនឹងទឹកយ៉ាងហោចណាស់ 30 µL ដែលគ្មាននុយក្លេស សម្រាប់ការងើបឡើងវិញកាន់តែប្រសើរ។ បន្ទាប់ពី QC បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ស្អាតអាចត្រូវបានប្រមូលផ្តុំទៅកម្រិតសំឡេងដែលចង់បានសម្រាប់ Hybridization និង Capture ។

ចំណាំ៖
ប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅផ្សេងទៀតអាចត្រូវបានប្រើដូចជា IDT និង Twist Biosciences ដោយប្រើបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ដែលត្រូវបានបង្កើតឡើង។ អនុវត្តតាមពិធីការពង្រឹងគោលដៅដែលបានបញ្ជាក់ដោយប្រើបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ជាការបញ្ចូល DNA ។ ប្រើ 5ul នៃ TELL-Seq™ TargetSeq Blocker បន្ថែមលើកម្មវិធីទប់ស្កាត់លម្អិតនៅក្នុងពិធីការនីមួយៗ។

SureSelect ការពង្រឹងគោលដៅ
ពិធីការខាងក្រោមគឺជាការកែប្រែនៃផ្នែក Hybridization and Capture System SureSelect XT HS Target Enrichment System សម្រាប់ Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing Library Protocol (Agilent, G9702-90000)។ ការកែប្រែអនុញ្ញាតឱ្យមានភាពឆបគ្នានៃ TELL-Seq™ WGS Library Prep ជាមួយនឹង Agilent SureSelect XT HS Target Enrichment System និងរាល់ Exon V8 Capture Probes ។ Agilent reagents សម្រាប់គ្រាន់តែ Hybridization និង Capture អាចត្រូវបានទិញដោយឡែកពីគ្នាក្នុងទម្រង់ 16-reaction (Agilent Part Number G9916B)។ ប្រសិនបើប្រើប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅផ្សេងទៀត អនុវត្តតាមពិធីការដែលបានបញ្ជាក់សម្រាប់ប្រព័ន្ធនីមួយៗ ហើយជំនួសបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ជាការបញ្ចូល DNA ។ 5ul នៃ TELL-Seq™ Target Blockers ក៏ត្រូវការជាចាំបាច់បន្ថែមលើអ្នកទប់ស្កាត់លម្អិតនៅក្នុងពិធីការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពគោលដៅនីមួយៗ

បង្កាត់បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ទៅកាន់បន្ទះថត Exome

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• SureSelect XT HS និង XT Low Input Blocker Mix, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module, Box 2 (Post PCR), ខៀវ)
• SureSelect RNase Block, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 2 (Post PCR), វីយ៉ូឡែត)
• SureSelect Fast Hybridization Buffer, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 2 (Post PCR), ដប)
• TELL-Seq™ Target Blocker (UST, TELL-Seq™ Target Blocker Box, ស)
• SSel XT HS និង XT Low Input Human All Exon V7 (Agilent, SSel XT HS និង XT Low Input Human All Exon V7, ក្រហម)
• ទឹកគ្មានជាតិគីមី (អ្នកប្រើប្រាស់)
• 0.2 mL បំពង់ PCR ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់)
• បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ (អ្នកប្រើប្រាស់)

ចំនួនទឹកប្រាក់បញ្ចូល	ប្រតិកម្ម Vol (មីលីលីត្រ)
500 -1,000 ng	រហូតដល់ 12 មីលីលីត្រ

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ
   

   ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
   SureSelect XT HS និង XT Low Input Blocker Mix	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	ត្រាំលើទឹកកក។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   SureSelect RNase Block	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	ត្រាំលើទឹកកក។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge  យ៉ាងខ្លី។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   SureSelect Fast Hybridization Buffer	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយហើយទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់
   TELL-Seq™ ឧបករណ៍ទប់ស្កាត់ TargetSeq	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   TELL-Seq™ បណ្ណាល័យ DNA	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយហើយទុកក្នុងទឹកកក

   SSel XT HS និង XT Low Input Human All Exon V8

   ពី -85 ° C ទៅ -75 ° C

   ត្រាំលើទឹកកក។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។

2. ដំឡើងកម្មវិធី Hybridization (HP) នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ (ជាមួយគម្របកំដៅ ON) ជាមួយនឹងកម្មវិធីខាងក្រោម។ ចាប់ផ្តើមកម្មវិធី បន្ទាប់មកចុចប៊ូតុងផ្អាកភ្លាមៗ ដោយអនុញ្ញាតឱ្យគម្របកំដៅឡើងដល់សីតុណ្ហភាព ខណៈពេលដែលអ្នករៀបចំប្រតិកម្ម។

លេខផ្នែក	ចំនួននៃវដ្ត	សីតុណ្ហភាព	ពេលវេលា
1	1	95°C	នាទី 5
2	1	65°C	នាទី 10
3	1	65°C	1 នាទី។
4	60	65°C 37°C	1 នាទី។ 3 វិនាទី
5	1	65°C	កាន់

នីតិវិធី

1. ដាក់ ​​500-1000 ng នៃបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ដែលបានរៀបចំនីមួយៗampចូលទៅក្នុងអណ្តូងបំពង់ឆ្នូត ហើយបន្ទាប់មកនាំយកបរិមាណចុងក្រោយក្នុងអណ្តូងនីមួយៗមក 12 µl ដោយប្រើទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអ៊ែ ប្រសិនបើចាំបាច់។ តាមឧត្ដមគតិធ្វើឱ្យសរុប ampLified TELL-Seq™ បណ្ណាល័យ DNA ក្នុងចន្លោះ 500–1000 ng ហើយប្រើទាំងអស់សម្រាប់ប្រតិកម្មបង្កាត់។
2. ទៅកាន់បណ្ណាល័យ TELL-Seq™ នីមួយៗampផងដែរ បន្ថែម 5 µl នៃ SureSelect XT HS និង XT Low Input Blocker Mix ហើយបន្ថែម 5 µl នៃ TELL-Seq™ Target Blocker ។ បិទអណ្តូងបន្ទាប់មក vortex ក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេល 5 វិនាទី។ បង្វិល​បំពង់​ឆ្នូត​មួយ​រយៈ​ខ្លី ដើម្បី​ប្រមូល​រាវ​បញ្ចេញ​ពពុះ។
3. ផ្ទេរបំពង់ទៅម៉ាស៊ីនកំដៅ ហើយចុចប៊ូតុង Play ដើម្បីបន្តការដំឡើងកម្មវិធី HP ។
   ចំណាំ៖
   ឧបករណ៍កង់កម្ដៅត្រូវតែផ្អាកក្នុងអំឡុងពេលផ្នែកទី 3 (សូមមើលក្រុមហ៊ុន HP) ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យសារធាតុបន្ថែមត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងអណ្តូង Hybridization ដូចដែលបានពិពណ៌នាក្នុងជំហានទី 6។ ក្នុងអំឡុងពេលផ្នែកទី 1 និងទី 2 នៃកម្មវិធីជិះកង់កម្ដៅ សូមចាប់ផ្តើមរៀបចំសារធាតុបន្ថែមដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង ជំហានទី 4 និងជំហានទី 5 ។ ប្រសិនបើចាំបាច់ អ្នកអាចបញ្ចប់ជំហានរៀបចំទាំងនេះ បន្ទាប់ពីផ្អាកម៉ាស៊ីនកំដៅក្នុងផ្នែកទី 3 ។
4. រៀបចំដំណោះស្រាយ 25% នៃប្លុក SureSelect RNase (មាន 1 ភាគនៃ RNase Block ជាមួយនឹងបរិមាណទឹក 3) យោងតាមតារាងខាងក្រោម។ រៀបចំបរិមាណដែលត្រូវការសម្រាប់ចំនួនប្រតិកម្មបង្កាត់ក្នុងការរត់ បូកនឹងលើស។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម

   បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (មីលីលីត្រ)

   កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 1 ប្រតិកម្ម		កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 8 ប្រតិកម្ម (រួមទាំងលើស)	កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 24 ប្រតិកម្ម (រួមទាំងលើស)
   SureSelect RNase Block	0.5 មីលីលីត្រ	4.5 មីលីលីត្រ	12.5 មីលីលីត្រ
   ទឹកគ្មានជាតិគីមី	1.5 មីលីលីត្រ	13.5 មីលីលីត្រ	37.5 មីលីលីត្រ

5. រៀបចំការលាយចម្រុះ Hybridization Library តាមលំដាប់ដូចខាងក្រោម។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម	បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (មីលីលីត្រ)
   	កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 1 ប្រតិកម្ម	កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 8 ប្រតិកម្ម (រួមទាំងលើស)	កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 24 ប្រតិកម្ម (រួមទាំងលើស)
   ដំណោះស្រាយប្លុក RNase 25%	2 មីលីលីត្រ	18 មីលីលីត្រ	50 មីលីលីត្រ
   SSel XT HS និង XT បញ្ចូលទាប Human All Exon V7	5 មីលីលីត្រ	45 មីលីលីត្រ	125 មីលីលីត្រ
   SureSelect Fast Hybridization Buffer	6 មីលីលីត្រ	54 មីលីលីត្រ	150 មីលីលីត្រ

   ផ្សំសារធាតុដែលបានរាយបញ្ជីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ លាយល្អដោយ vortexing ក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេល 5 វិនាទីបន្ទាប់មកបង្វិលចុះដោយខ្លី។ បន្តទៅជំហានទី 6 ភ្លាមៗ។

6. នៅពេលដែលម៉ាស៊ីនកំដៅចាប់ផ្តើមផ្នែកទី 3 នៃ HP (1 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 65°C) សូមចុចប៊ូតុងផ្អាក។ ជាមួយនឹងអ្នកជិះកង់បានផ្អាក ហើយខណៈពេលដែលរក្សា DNA + Blocker samples នៅក្នុងអ្នកជិះកង់ ផ្ទេរ 13 µl នៃសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ ថត Hybridization Mix បណ្ណាល័យពីជំហានទី 6 ទៅ s នីមួយៗampលាហើយ លាយ​ឱ្យ​សព្វ​ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​យឺតៗ ៨ ទៅ ១០ ដង។ អណ្តូងប្រតិកម្មកូនកាត់ឥឡូវនេះមានប្រហែល 8 μl
7. ត្រូវប្រាកដថាអណ្តូងទាំងអស់ត្រូវបានបិទជិតទាំងស្រុង។ Vortex ដោយសង្ខេប បន្ទាប់មកបង្វិលបំពង់ឆ្នូតដោយខ្លី ដើម្បីយកពពុះចេញពីបាតអណ្តូង។ ត្រឡប់​បំពង់​ឆ្នូត​ទៅ​ម៉ាស៊ីន​កម្ដៅ​ភ្លាមៗ។
8. ចុច​ប៊ូតុង Play ដើម្បី​បន្ត​កម្មវិធី​ជិះកង់​កម្ដៅ ដើម្បី​អនុញ្ញាត​ឱ្យ​មាន​ការ​បង្កាត់​ DNA ដែល​បាន​រៀបចំamples ទៅបណ្ណាល័យចាប់យក។

រៀបចំអង្កាំម៉ាញ៉េទិចដែលស្រោបដោយ Streptavidin

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (អ្នកប្រើប្រាស់)
• SureSelect Binding Buffer (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 1 (Post PCR), CAP)

ការរៀបចំ

រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	ពី 2°C ទៅ 8°C	រំញ័រយ៉ាងខ្លាំងក្លា។ រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
SureSelect Binding Buffer,	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

នីតិវិធី

1. បញ្ឈប់អង្កាំមេដែក Dynabeads MyOne Streptavidin T1 ឡើងវិញយ៉ាងខ្លាំងក្លានៅលើឧបករណ៍លាយ vortex ។ អង្កាំម៉ាញេទិកដោះស្រាយកំឡុងពេលផ្ទុក។
2. សម្រាប់ hybridization នីមួយៗ sample បន្ថែម 50 µl នៃអង្កាំដែលព្យួរឡើងវិញទៅក្នុងអណ្តូងនៃចាន PCR ស្រស់ ឬបំពង់ឆ្នូត។
3. លាងសម្អាតអង្កាំដោយបន្ថែម 200 µl នៃ SureSelect Binding Buffer ។ លាយ​ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​២០​ដង ឬ​បិទ​អណ្តូង និង​ខ្យល់​ក្នុង​ល្បឿន​លឿន​រយៈពេល ៥-១០​វិនាទី។
4. ដាក់ចានឬបំពង់ឆ្នូតចូលទៅក្នុងឧបករណ៍បំបែកម៉ាញេទិក។
5. រង់ចាំយ៉ាងហោចណាស់ 5 នាទី ឬរហូតទាល់តែដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់ បន្ទាប់មកយកវាចេញ ហើយបោះចោលកំពូល។
6. ធ្វើម្តងទៀតជំហាន 3-5 ពីរដងទៀតសម្រាប់ការលាងសរុបចំនួន 3 ។
7. ផ្អាកអង្កាំនៅក្នុង 200 µl នៃ SureSelect Binding Buffer ។

ចាប់យក DNA កូនកាត់ដោយប្រើ Streptavidin-coated Beads

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• SureSelect Wash Buffer 1, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 1 (Post PCR), )
• SureSelect Wash Buffer 2, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 1 (Post PCR), )

ការរៀបចំ

រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
SureSelect Wash Buffer 1,	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
SureSelect Wash Buffer 2,	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	កំដៅ 200 μl aliquots នៅ 70 ° C ។ សូមមើលជំហានទី 4

នីតិវិធី

1. បន្ទាប់​ពី​ជំហាន​បង្កាត់​ត្រូវ​បាន​បញ្ចប់ ហើយ​ម៉ាស៊ីន​កម្ដៅ​ឈាន​ដល់​ជំហាន​កាន់ 65°C សូម​ផ្ទេរ samples ទៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
2. ផ្ទេរភ្លាមៗនូវបរិមាណទាំងមូល (ប្រហែល 30 µl) នៃល្បាយកូនកាត់នីមួយៗទៅអណ្តូងដែលមាន 200 µl នៃអង្កាំ streptavidin ដែលត្រូវបានលាងសម្អាតដោយប្រើបំពង់ពហុឆានែល។ បំពង់ឡើងលើចុះក្រោម 5-8 ដងដើម្បីលាយ។
3. ដាក់បំពង់ឆ្នូតចាប់យកនៅលើឧបករណ៍លាយចាន 96 អណ្តូងដោយលាយយ៉ាងខ្លាំងក្លា (នៅ 1400-1800 rpm) ឬ rotator រយៈពេល 30 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ត្រូវប្រាកដថា សamples ត្រូវបានលាយឱ្យបានត្រឹមត្រូវនៅក្នុងអណ្តូង។
4. បន្តទៅជំហានបន្ទាប់ភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការ incubation ។ ក្នុងអំឡុងពេលនៃការភ្ញាស់រយៈពេល 30 នាទីសម្រាប់ការចាប់យក សូមធ្វើការកក់ទុកជាមុន SureSelect Wash Buffer 2 នៅ 70°C ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងក្រោម។ ដាក់ ​​200 μl aliquots នៃ Wash Buffer 2 នៅក្នុងអណ្តូងនៃចានអណ្តូង 96 ស្រស់ ឬបំពង់ឆ្នូត។ Aliquot 6 អណ្តូងនៃទ្រនាប់សម្រាប់ DNA នីមួយៗampឡេនៅក្នុងការរត់។ ខ្ទប់អណ្តូង ហើយបន្ទាប់មកដាក់ក្នុងម៉ាស៊ីនកំដៅ ដោយបើកគម្របកំដៅ ទុកនៅសីតុណ្ហភាព 70°C រហូតដល់ប្រើក្នុង
5. នៅពេលដែលរយៈពេល incubation 30 នាទីដែលបានផ្តួចផ្តើមក្នុងជំហានទី 3 ត្រូវបានបញ្ចប់ សូមបង្វិល samples ក្នុងរយៈពេលខ្លីដើម្បីប្រមូលរាវ។
6. ដាក់បំពង់ឆ្នូតក្នុងឧបករណ៍បំបែកមេដែក ដើម្បីប្រមូលអង្កាំ។ រង់ចាំ​រហូត​ដល់​ដំណោះ​ស្រាយ​ច្បាស់​លាស់ រួច​យក​ចេញ​ហើយ​បោះ​ចោល​សារធាតុ​ដែល​លើស។
7. ផ្អាកអង្កាំម្តងទៀតក្នុង 200 µl នៃ SureSelect Wash Buffer 1. លាយដោយដាក់បំពង់ឡើងលើ និងចុះក្រោម 15-20 ដង រហូតដល់អង្កាំត្រូវបានផ្អាកទាំងស្រុង។
8. ដាក់បំពង់ឆ្នូតនៅក្នុងឧបករណ៍បំបែកមេដែក។ រង់ចាំដំណោះស្រាយឱ្យច្បាស់ (ប្រហែល 1 នាទី) បន្ទាប់មកយកវាចេញ ហើយបោះចោលកំពូល។
9. ដោះបំពង់ឆ្នូតចេញពីឧបករណ៍បំបែកមេដែក ហើយផ្ទេរទៅ rack នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ផ្អាកអង្កាំឡើងវិញក្នុង 200 µl នៃ 70°C ធុងទឹកលាងមុនកំដៅ 2. បំពង់ឡើងចុះ 15-20 ដង រហូតដល់អង្កាំត្រូវបានផ្អាកទាំងស្រុង។ បិទអណ្តូងជាមួយមួកស្រស់ ហើយបន្ទាប់មក vortex ក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេល 8 វិនាទី។ បង្វិលចាន ឬបំពង់ឆ្នូតដោយសង្ខេប ដើម្បីប្រមូលអង្គធាតុរាវដោយមិនចាំបាច់ចាក់អង្កាំ។
10. ភ្ញាស់ សamples រយៈពេល 5 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 70 ° C នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅដោយគម្របកំដៅ។
11. ដាក់បំពង់ឆ្នូតនៅក្នុងឧបករណ៍បំបែកមេដែកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ រង់ចាំ 1 នាទីដើម្បីឱ្យសូលុយស្យុងជម្រះបន្ទាប់មកយកចេញហើយបោះបង់ចោល supernatant ។
12. ធ្វើជំហានទី 9-11 ម្តងទៀត 6 ដងទៀត សម្រាប់ការលាងសរុបចំនួន XNUMX ។
13. បន្ទាប់ពីផ្ទៀងផ្ទាត់ថា សតិបណ្ដោះអាសន្នលាងសម្អាតទាំងអស់ត្រូវបានដកចេញ សូមបន្ថែមទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអែរ 25 µl ទៅក្នុងទឹកនីមួយៗ។ampលាហើយ Pipette ឡើងនិងចុះ 8 ដងដើម្បីព្យួរអង្កាំឡើងវិញ។ សamples អាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅលើទឹកកកពីមុន ampការធ្វើត្រាប់តាម

Amplify បណ្ណាល័យចាប់យក

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• 5 × Herculase II Reaction Buffer (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Clear)
• Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Red)
• 100 mM dNTP Mix, (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Green)
• SureSelect Post-Capture Primer Mix (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Clear)

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ
   

   ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
   5 × សតិបណ្ដោះអាសន្ន Herculase II	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ទៅ លាយបន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   Herculase II Fusion DNA Polymerase	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   100 mM dNTP លាយ	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ទៅ  លាយបន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
   SureSelect Post-Capture Primer Mix	ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C	រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។

2. រៀបចំកម្មវិធីខាងក្រោមនៅលើម៉ាស៊ីនកម្តៅទឹកដូចខាងក្រោម៖
   • 98°C 2 នាទី។
   • [98°C 30 វិនាទី, 63°C 30 វិនាទី, 72°C 1 នាទី] x 9
   • 72°C 5 នាទី។
   • 4°C ជារៀងរហូត

នីតិវិធី

1. រៀបចំបរិមាណសមស្របនៃល្បាយប្រតិកម្ម PCR ។ បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោមទៅបំពង់ PCR ដោយផ្អែកលើចំនួនប្រតិកម្ម។
   

   សារធាតុប្រតិកម្ម	បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (µL)
   	កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 1 ប្រតិកម្ម	កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 8 ប្រតិកម្ម (រួមទាំងលើស)	កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 24 ប្រតិកម្ម (រួមទាំងលើស)
   ទឹកគ្មានជាតិគីមី	12.5 μL	112.5 μL	312.5 μL
   5 × សតិបណ្ដោះអាសន្ន Herculase II	10 μL	90 μL	250 μL
   Herculase II Fusion DNA Polymerase	1 μL	9 μL	25 μL
   100 mM dNTP លាយ	0.5 μL	4.5 μL	12.5 μL
   SureSelect Post-Capture Primer Mix	1 μL	9 μL	25 μL

2. រៀបចំបរិមាណសមស្របនៃល្បាយប្រតិកម្ម PCR ។ បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោមទៅបំពង់ PCR ដោយផ្អែកលើចំនួនប្រតិកម្ម។ បន្ថែម 25 µl នៃល្បាយប្រតិកម្ម PCR ដែលបានរៀបចំក្នុងតារាងទី 29 ទៅ s នីមួយៗampលេមានផ្ទុក 25 µl នៃ DNA ដែលសំបូរទៅដោយគ្រាប់អង្កាំគោលដៅ (រៀបចំនៅទំព័រទី 26 ហើយទុកនៅលើទឹកកក)។
3. លាយប្រតិកម្ម PCR ឱ្យបានល្អដោយបំពង់ឡើងលើចុះក្រោមរហូតដល់ការព្យួរអង្កាំមានភាពដូចគ្នា។ ជៀសវាងការបាញ់ទឹក samples នៅលើជញ្ជាំងអណ្តូង; កុំបង្វិល samples នៅជំហាននេះ។
4. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ ហើយដំណើរការកម្មវិធី (សូមមើលខាងលើ) ជាមួយនឹងចំនួនវដ្តត្រឹមត្រូវ។
5. នៅពេលដែល PCR ampកម្មវិធី lification ត្រូវបានបញ្ចប់ បង្វិលបំពង់ឆ្នូតដោយសង្ខេប។ ដោះអង្កាំដែលស្រោបដោយសារធាតុ streptavidin ដោយដាក់ចាន ឬបំពង់ឆ្នូតនៅលើទីតាំងម៉ាញ៉េទិចនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ រង់ចាំ 2 នាទីដើម្បីឱ្យសូលុយស្យុងជម្រះចេញ បន្ទាប់មកយក supernatant នីមួយៗ (ប្រហែល 50 μl) ទៅកាន់អណ្តូងនៃបំពង់ឆ្នូត។

សម្អាតបណ្ណាល័យដែលចាប់យក 

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• AMPure XP (អ្នកប្រើប្រាស់)
• ភស្តុតាងអេតាណុល 200 (ដាច់ខាត) សម្រាប់ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល (អ្នកប្រើប្រាស់)
• ទឹកគ្មានជាតិគីមី (អ្នកប្រើប្រាស់)
• TE buffer, pH 8.0 (អ្នកប្រើប្រាស់)
• 0.2 mL បំពង់ PCR ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់)

ការរៀបចំ

រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ	ការផ្ទុក	ការណែនាំ
អេតាណុលស្រស់ 75% (v/v)	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	ត្រូវការ 400 មីលីលីត្រក្នុងមួយវិនាទីampលេ លាយ 1.5 mL អេតាណុល (200 ភស្តុតាង) ជាមួយ 0.5 mL ទឹកគ្មាននុយក្លេអ៊ែ។ Vortex ដើម្បីលាយនិងរក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
AMPយូ XP	ពី 2°C ទៅ 8°C	យកវាទៅសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់យ៉ាងហោចណាស់ 20 នាទី ហើយកូរឱ្យខ្លាំង ដើម្បីផ្អាកអង្កាំមុនពេលប្រើ។
ទឹកគ្មានជាតិគីមី	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
TE buffer, pH 8.0	សីតុណ្ហភាពបន្ទប់	រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

នីតិវិធី

1. ទម្លាក់ដំណោះស្រាយជាមួយនឹងការបង្វិលយ៉ាងលឿន ~ 1 វិនាទីនៅក្នុង centrifuge ។
2. Vortex យ៉ាងខ្លាំងក្លាដើម្បីផ្អាកដំណើរការឡើងវិញ AMPដំណោះស្រាយ ure XP និងបន្ថែម 50 μL AMPure XP ទៅក្នុងផលិតផល PCR នីមួយៗ។
3. លាយដោយបំពង់ឡើងលើចុះក្រោម 10 ដង។
4. ដុតនំនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 5 នាទី។
5. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
6. ប្រាថ្នា​ហើយ​បោះចោល​អតិរេក​ដោយ​គ្មាន​ការ​រំខាន AMPអង្កាំអ៊ុយ។
7. ខណៈពេលដែលរក្សាបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិក បន្ថែម 200 µL អេតាណុល 75% ដែលបានរៀបចំថ្មីៗទៅក្នុងបំពង់។ ទុកឱ្យវាអង្គុយរយៈពេល 30 វិនាទី។
8. ប្រាថ្នា​ហើយ​បោះចោល​អណ្តែត​ដោយ​គ្មាន​អង្កាំ​រំខាន។
9. ធ្វើជំហានទី 7-8 ម្ដងទៀត ដោយរក្សាបំពង់នៅលើទីតាំងម៉ាញេទិកពេញមួយពេល។
10. ទុកបំពង់នៅលើទីតាំងម៉ាញេទិកដោយបើកគម្រប ហើយទុកឱ្យបំពង់ស្ងួតរយៈពេល 1-2 នាទី ដើម្បីហួតដានអេតាណុល។ កុំស្ងួតអង្កាំពេក។
11. ដោះបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់មេដែក ហើយបន្ថែម 25 µL TE buffer ទៅក្នុងអង្កាំ។
12. Pipette ឬ vortex ដើម្បីផ្អាកអង្កាំ។ ទុកឱ្យវាអង្គុយរយៈពេល 5 នាទី។
13. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
14. យកមកវិញនូវ 23 µL នៃ supernatant ទៅបំពង់ថ្មីមួយ។ ប្រយ័ត្នកុំរំខានអង្កាំ។
15. supernatant មានបណ្ណាល័យ TELL-Seq™ ដែលបានចាប់យក។

ចំណាំ៖
នេះ​ជា​ចំណុច​ឈប់​ដោយ​សុវត្ថិភាព។ បណ្ណាល័យ TELL-Seq ដែលចាប់យកអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25°C ដល់ -15°C រយៈពេលប្រាំមួយខែ។

មានលក្ខណៈគ្រប់គ្រាន់ និងកំណត់បរិមាណបណ្ណាល័យដែលចាប់យកសម្រាប់លំដាប់លំដោយ

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

• Agilent Bioanalyzer សំណុំ DNA ភាពរសើបខ្ពស់ ឬ TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay (អ្នកប្រើប្រាស់)
• Qubit dsDNA HS Assay Kit (អ្នកប្រើប្រាស់)
• TE buffer, pH 8.0 (អ្នកប្រើប្រាស់)

ការរៀបចំ

1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ចាំបាច់តាមតម្រូវការរបស់ Bioanalyzer ឬ TapeStation និង Qubit ។

នីតិវិធី

1. ប្រើបណ្ណាល័យ 1 µL សម្រាប់ Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit ឬ 2 µL នៃបណ្ណាល័យសម្រាប់ TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay ។
2. ដើម្បីកំណត់កំហាប់បណ្ណាល័យ សូមកំណត់តំបន់នៅលើកម្មវិធីវិភាគ Bioanalyzer ឬ TapeStation ពី 150 bp ទៅ 1000 bp ។ កត់ត្រា សample ការប្រមូលផ្តុំ (nM) សម្រាប់តំបន់នេះ (សូមមើលរូបភាពទី 2) ។ ដើម្បីកំណត់ទំហំបណ្ណាល័យ សូមកំណត់តំបន់ពី 150 bp ទៅ 3000 bp ។ កត់ត្រា សample ទំហំមធ្យម (bp) ជាទំហំបណ្ណាល័យ។
   ប្រយ័ត្ន
   ការអានការផ្តោតអារម្មណ៍ពី Bioanalyzer (ឬ TapeStation) គួរតែត្រូវបានប្រើជាចំណុចចាប់ផ្តើមដើម្បីធ្វើឱ្យការរំលាយចាំបាច់ ឬការរួមបញ្ចូលបណ្ណាល័យសម្រាប់លំដាប់។ ផ្ទៀងផ្ទាត់ការប្រមូលផ្តុំនៃបណ្ណាល័យ ឬបណ្តុំបណ្ណាល័យចុងក្រោយដែលរំលាយដោយឧបករណ៍ Qubit dsDNA HS Assay (សូមមើលជំហានទី 6) ។រូបភាពទី 2. ឧample of exome captured library profile ពី ស្ថានីយកាសែត ស្គ្រីន ឌី 5000 ការវិភាគ តេស ស្គ្រីន ភាពរសើបខ្ពស់ ។
3. បណ្ណាល័យអាចត្រូវបានបន្តបន្ទាប់គ្នាភ្លាមៗ ឬរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25°C ដល់ -15°C។
4. ពេល​ធ្វើ​តាម​លំដាប់ សូម​ពនឺ​បណ្ណាល័យ​ដោយ​ប្រើ TE buffer ទៅ​នឹង​កំហាប់​ដែល​បាន​ណែនាំ​ដោយ​ប្រព័ន្ធ​លំដាប់ Illumina® នីមួយៗ។ បង្កើត​បណ្ណាល័យ​ចម្រុះ​សម្រាប់​ការ​តាម​លំដាប់​លំដោយ ប្រសិនបើ​បណ្ណាល័យ​ច្រើន​ជាង​មួយ​នឹង​ត្រូវ​បាន​បន្តបន្ទាប់​គ្នា​ក្នុង​ការ​ដំណើរការ​ដូចគ្នា។
5. វាស់កំហាប់បណ្ណាល័យដោយប្រើ Qubit dsDNA HS Assay Kit ។ ប្រើតម្លៃទំហំមធ្យមពីការវាស់វែង Bioanalyzer (ឬ TapeStation) ជាទំហំបណ្ណាល័យសម្រាប់ការបំប្លែងកំហាប់ម៉ាសទៅជាកំហាប់ molar (nM)។

A = ការប្រមូលផ្តុំម៉ាស (ng/µL)
S = ទំហំបណ្ណាល័យ (bp)
ការផ្តោតអារម្មណ៍ Molar (nM) = (A*1,000,000)/(S*650)
កែតម្រូវកម្រិតសំឡេងដែលត្រូវការក្នុងការរៀបចំលំដាប់លំដោយ ប្រសិនបើកំហាប់បណ្ណាល័យដែលវាស់ដោយ Qubit ខុសពីកំហាប់ដែលបានណែនាំលើសពី 10%។

ឯកសារ/ធនធាន

ការពង្រឹងគោលដៅជាសកល TELL-Seq [pdf] ការណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់ ការពង្រឹងគោលដៅ TELL-Seq, TELL-Seq, ការពង្រឹងគោលដៅ, ការពង្រឹង

ឯកសារយោង

• សៀវភៅណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់