100035 TELL Seq ការពង្រឹងគោលដៅ

“

លក្ខណៈ​ពិសេស៖

• ឈ្មោះផលិតផល៖ TELL-SeqTM Target Enrichment Kit
• ក្រុមហ៊ុនផលិត: Universal Sequencing Technology Corporation
• សម្រាប់ការប្រើប្រាស់ស្រាវជ្រាវតែប៉ុណ្ណោះ។ មិនមែនសម្រាប់ប្រើក្នុងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យទេ។
  នីតិវិធី
• ការបញ្ចូល DNA ហ្សែន៖ ទាមទារ 5ng, DNA ទម្ងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់។
  បានណែនាំ

សេចក្តីណែនាំអំពីការប្រើប្រាស់ផលិតផល៖

1. សេចក្តីផ្តើម

TELL-SeqTM Target Enrichment Kit ត្រូវបានរចនាឡើងសម្រាប់ហ្សែន
កម្មវិធីលំដាប់។ វាចាំបាច់ណាស់ក្នុងការធ្វើតាមការណែនាំ
ផ្តល់ជូននៅក្នុងការណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់នេះសម្រាប់ការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ត្រឹមត្រូវ និងសុវត្ថិភាព។

មាតិកាឧបករណ៍

កញ្ចប់រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM មានប្រអប់ពីរ
សារធាតុប្រតិកម្ម៖

• ប្រអប់ទី 1៖ មានផ្ទុកសារធាតុជាច្រើនរួមទាំង
  អង់ស៊ីម Barcoding, Exonuclease, Tagging អង់ស៊ីម និងច្រើនទៀត។ កុំ
  បង្កក និងរលាយសារធាតុទាំងនេះលើសពី 6 ដង។
• ប្រអប់ទី 2៖ មាន TELL Bead Plex, Wash Solution,
  និងបញ្ឈប់ដំណោះស្រាយ។ ធានាបាននូវការគ្រប់គ្រងត្រឹមត្រូវនៃដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ជា
  តាមការណែនាំដែលបានផ្តល់។

3. ការណែនាំអំពីការបញ្ចូល DNA ហ្សែន

សម្រាប់​ការ​រៀបចំ​លំដាប់​ដោយ​ជោគជ័យ 5ng នៃ DNA ហ្សែន​ត្រូវ​បាន​ទាមទារ។ ខ្ពស់។
DNA ទម្ងន់ម៉ូលេគុលមានសារៈសំខាន់សម្រាប់លទ្ធផលល្អបំផុតជាមួយ TELL-SeqTM
លំដាប់។

4. TELL-SeqTM Human Exome Capture Workflow

អនុវត្តតាមដំណើរការការងារលម្អិតដែលមាននៅក្នុងការណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់សម្រាប់
ការចាប់យក exome របស់មនុស្សដោយប្រើឧបករណ៍ TELL-SeqTM ។

5. ពិធីការ

សូមមើលផ្នែកពិធីការនៃការណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់សម្រាប់ជំហានដោយជំហាន
ការណែនាំអំពីការប្រើប្រាស់ TELL-SeqTM Target Enrichment Kit ។

សំណួរគេសួរញឹកញាប់៖

សំណួរ៖ តើខ្ញុំគួរធ្វើដូចម្តេចប្រសិនបើដំណោះស្រាយបញ្ឈប់នៅក្នុងប្រអប់ទី 2 មិនច្បាស់លាស់
ឬមានទឹកភ្លៀងពណ៌ស?

A: ប្រសិនបើដំណោះស្រាយបញ្ឈប់មិនច្បាស់ឬមាន
precipitates, កំដៅបំពង់ឡើងនៅ 37 ° C, vortex ដើម្បីរំលាយណាមួយ។
precipitate និងរក្សាទុកដំណោះស្រាយដែលបានផ្អាកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់
សម្រាប់ការប្រើប្រាស់នាពេលអនាគត។

“`

TELL-SeqTM មគ្គុទ្ទេសក៍អ្នកប្រើប្រាស់បង្កើនកម្រិតគោលដៅ
សម្រាប់ការប្រើប្រាស់ស្រាវជ្រាវតែប៉ុណ្ណោះ។ មិនមែនសម្រាប់ប្រើក្នុងដំណើរការរោគវិនិច្ឆ័យទេ។ ឯកសារ #100032-USG v5.0 ខែកុម្ភៈ ឆ្នាំ 2025

ឯកសារនេះមានកម្មសិទ្ធិរបស់ក្រុមហ៊ុន Universal Sequencing Technology Corporation ហើយត្រូវបានបម្រុងទុកសម្រាប់តែការប្រើប្រាស់របស់អតិថិជនរបស់ខ្លួនទាក់ទងនឹងការប្រើប្រាស់ផលិតផលដែលបានពិពណ៌នានៅទីនេះ និងមិនមានគោលបំណងផ្សេងទៀតទេ។
ការណែនាំនៅក្នុងឯកសារនេះត្រូវតែអនុវត្តតាមយ៉ាងជាក់លាក់ដោយបុគ្គលិកដែលបានទទួលការបណ្តុះបណ្តាលត្រឹមត្រូវ ដើម្បីធានាបាននូវការប្រើប្រាស់ឧបករណ៍ TELL-SeqTM ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ និងប្រកបដោយសុវត្ថិភាព។
សាជីវកម្មបច្ចេកវិទ្យាលំដាប់លំដោយសកលមិនទទួលខុសត្រូវណាមួយដែលកើតឡើងបន្ទាប់ពីការប្រើប្រាស់មិនត្រឹមត្រូវនៃ TELL-SEQTM KIT។
© 2023 សាជីវកម្មបច្ចេកវិទ្យាលំដាប់សកល។ រក្សាសិទ្ធិគ្រប់យ៉ាង។
TELL-SeqTM គឺជាពាណិជ្ជសញ្ញារបស់ក្រុមហ៊ុន Universal Sequencing Technology Corporation។ ឈ្មោះ ស្លាកសញ្ញា និងពាណិជ្ជសញ្ញាផ្សេងទៀតទាំងអស់ គឺជាកម្មសិទ្ធិរបស់ម្ចាស់រៀងៗខ្លួន។

កែប្រែប្រវត្តិឯកសារ #100032-USG v1.0 Doc #100032-USG v2.0 Doc #100032-USG v3.0
Doc #100032-USG v4.0
Doc #100032-USG v5.0

ខែវិច្ឆិកា ឆ្នាំ 2021 ខែសីហា ឆ្នាំ 2022 ខែសីហា ឆ្នាំ 2023
ខែសីហា ឆ្នាំ 2024 ខែកុម្ភៈ ឆ្នាំ 2025

ការអាប់ដេតពិធីការចេញផ្សាយដំបូងដើម្បីដំណើរការជាមួយឧបករណ៍ត្រៀមបណ្ណាល័យ TELLSeqTM ដែលបានធ្វើបច្ចុប្បន្នភាព V1 ជាមួយនឹងជម្រើស Suspension Buffer EZ និងជម្រើស TELL Bead Plex ដែលបានលុបជម្រើស TELL Bead ។ មានតែ TELL Bead Plex ប៉ុណ្ណោះដែលត្រូវបានប្រើប្រាស់ឆ្ពោះទៅមុខ។ បានបន្ថែមចំណាំ និងរូបភាពជាមួយនឹងប្រព័ន្ធលាយដែលបានណែនាំសម្រាប់ជំហានសំខាន់នៃការបង្វិលបំពង់ត្រឹមត្រូវក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការបាកូដ ដើម្បីរក្សាលក្ខណៈសម្បត្តិ DNA ដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់។ បានផ្លាស់ប្តូរការណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់សម្រាប់ការពង្រឹងគោលដៅទូទៅ។ បានបន្ថែមព័ត៌មានបន្ថែមអំពីការប្រើ TELL-SeqTM Library Prep ជាមួយនឹងប្រព័ន្ធ Target Enrichment ផ្សេងទៀត។
បង្កើនបរិមាណថ្នាំ primer ទ្វេដងនៅក្នុង TELLSeqTM Illumina® Sequencing Primer Kit (PN 100004 និង PN 100013)

2 100032-USG V5.0

តារាងមាតិកា
1. សេចក្តីផ្តើម ……………………………………………………………………………………………………………………… 4 ការណែនាំអំពីការបញ្ចូល DNA ហ្សែន………………………………………………………………………………. ៤
2. Kit Contents ……………………………………………………………………………………………………………………… 5 TELL-SeqTM Library Prep Kit, Standard Size ………………………………………………………………………….. 5 Box 1 of 2: TELL-SeqTM Library Reagent Box 1 V1 ………………………………………………………………… 5 Box 2 of 2: TELL-SeqTM Library Reagent Box 2 Prime SeqTM ……………………………………. (1-5) កញ្ចប់………………………………………………………………………………. 1 TELL-SeqTM Library Multiplex Primer (8-6) Kit …………………………………………………………………….. 9 TELL-SeqTM Library Multiplex Primer (16-7) Kit ………………………………………………………………… 17 TELL-SeqTM Illumina® Sequencing Primer Kit ……………………………………………………………………………….. 24 TELL-SeqTM Incing T Primer® Sequer, TELL-SeqTM Target Blocker (PN 7) ………………………………………………………………………………. ៨
3. សម្ភារៈប្រើប្រាស់ និងបរិក្ខារ (មិនផ្តល់ជូន) …………………………………………………………………………. 9 សម្ភារៈប្រើប្រាស់……………………………………………………………………………………………………………………….. 9 *អាស្រ័យលើប្រព័ន្ធណាមួយដែលមាននៅក្នុងកន្លែងអ្នកប្រើប្រាស់។ …………………………………………………….. ៩ បរិក្ខារ………………………………………………………………………………………………………………………….. ៩
4. TELL-SeqTM Human Exome Capture Workflow ……………………………………………………………………. 10 5. ពិធីការ………………………………………………………………………………………………………………………. ១១
A. TELL-SeqTM WGS Library Prep…………………………………………………………………………………………… 11 Barcode DNA……………………………………………………………………………………………………………………… 11 ធ្វើអោយ DNA ស្ថេរភាព……………………………………………………………………………………………………………………….. 14 Tagment DNA……………………………………………………………………………………………………………………….. 14 Wash Beads ………………………………………………………………………………………………………………………. ១៥ Amplify Library …………………………………………………………………………………………………………….. 17 Clean Up Library……………………………………………………………………………………………………………. 18 គុណភាព និងបរិមាណបណ្ណាល័យសម្រាប់ការពង្រឹងគោលដៅ ………………………………………………………………… 21 B. SureSelect Target Enrichment …………………………………………………………………………………. 23 Hybridize TELL-SeqTM Library ទៅកាន់ Exome Capture Panel …………………………………………………… 23 រៀបចំ Streptavidin-coated Magnetic Beads ……………………………………………………………………. 25 ចាប់យក DNA កូនកាត់ដោយប្រើ Streptavidin-coated Beads …………………………………………………….. 26 Amplify Captured Library ……………………………………………………………………………………………….. 27 Clean Up Captured Library …………………………………………………………………………………………… 28 គុណវុឌ្ឍិ និងបរិមាណបណ្ណាល័យដែលថតទុកសម្រាប់ដាក់ជាលំដាប់………………………………………………………………… 29
3 100032-USG V5.0

1. សេចក្តីផ្តើម
ពិធីសារនេះពន្យល់ពីរបៀបរៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ដែលត្រូវបានបង្កើតជាលិបិក្រមដែលបានពង្រឹងគោលដៅដោយការចាប់យកការបង្កាត់ដោយប្រើការរួមបញ្ចូលគ្នានៃ TELL-SeqTM Library Prep Kit និង Agilent® SureSelect Target Enrichment System ។ ប្រព័ន្ធ TELL-SeqTM Library Prep Kit ក៏អាចប្រើបានជាមួយប្រព័ន្ធ Target Enrichment ផ្សេងទៀតដូចជា IDT និង Twist Biosciences ផងដែរ។ ឧបករណ៍ត្រៀមបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ប្រើប្រាស់បច្ចេកវិទ្យា Transposase Enzyme Linked Long-read Sequencing (TELL-SeqTM) ប្រកបដោយភាពច្នៃប្រឌិត ដើម្បីរៀបចំបណ្ណាល័យដែលមានគូដើម្បីបង្កើតការអានដែលភ្ជាប់បាកូដពីប្រព័ន្ធលំដាប់ Illumina®។ Agilent® SureSelect Target Enrichment System អនុញ្ញាតឱ្យមានការពង្រឹងតំបន់គោលដៅ ដោយប្រើការស៊ើបអង្កេតចាប់យកជាក់លាក់ខ្ពស់។ ប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅនីមួយៗមានបន្ទះស៊ើបអង្កេតតែមួយគត់ដែលអនុញ្ញាតឱ្យចាប់យកតំបន់ជាក់លាក់ដែលត្រូវគ្នាជាមួយបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ។
ការណែនាំអំពីការបញ្ចូល DNA ហ្សែន
5ng DNA ហ្សែនត្រូវបានទាមទារសម្រាប់ពិធីការនេះ។ ទម្ងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់ (HMW) DNA គឺមានសារៈសំខាន់សម្រាប់ការរៀបចំលំដាប់ TELL-SeqTM ប្រកបដោយជោគជ័យ។
· សម្រាប់ហ្សែនរបស់មនុស្ស អប្បបរមា sampទំហំ DNA គួរតែធំជាង 40Kb។ · HMW DNA ចាប់ពី 100Kb ដល់ 300Kb គឺជាសម្ភារៈដ៏ល្អបំផុតសម្រាប់ដំណាក់កាលដ៏ល្អបំផុតរបស់មនុស្ស
កម្មវិធី។ · ជៀសវាងការបំបែក HMW DNA កំឡុងពេលដោះស្រាយ។ យក DNA ទម្ងន់ម៉ូលេគុលទាប (កំណត់ថាជា
smear តិចជាង 10Kb នៅលើជែល) នៅក្នុង sample ប្រសិនបើពួកគេបង្ហាញផ្នែកសំខាន់នៅក្នុង DNA sampលេ ប្រើវិធីសាស្រ្តដែលមានមូលដ្ឋានលើ fluorometric ដើម្បីកំណត់បរិមាណ DNA បញ្ចូល។ ប្រសិនបើអ្នកប្រើ Qubit dsDNA BR Assay Kit ឬ HS Kit សូមប្រើយ៉ាងហោចណាស់ 2 L នៃ DNA នីមួយៗampឡេសម្រាប់ការវាស់វែង។ ជៀសវាងវិធីសាស្រ្តដែលវាស់តែកំហាប់អាស៊ីត nucleic សរុប ដូចជា NanoDrop ឬវិធីសាស្ត្រស្រូបកាំរស្មី UV ផ្សេងទៀត។ សម្រាប់ការវាស់វែងត្រឹមត្រូវនៃកំហាប់ HMW DNA ពនឺ DNA ប្រមូលផ្តុំទៅកំហាប់ការងារ (0.4ng/l ដល់ 1ng/l) ក្នុង Tris buffer (pH 7.5-8.0) ជាច្រើនម៉ោងទៅមួយថ្ងៃមុនពេលវាស់កំហាប់ និងការរៀបចំបណ្ណាល័យ។ DNA ហ្សែនគួរតែត្រូវបានរក្សាទុកនៅក្នុងបណ្តុំ Tris ដែលមាន pH ចាប់ពី 7.5 ដល់ 8.0 ឬសតិបណ្ដោះអាសន្ន TE ទាប (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)។ សម្រាប់ការវាយតម្លៃភាពបរិសុទ្ធនៃ DNA sample, សមាមាត្រនៃការវាស់ស្រូបនៅ 260 nm ទៅនឹងការស្រូបយកនៅ 280 nm អាចត្រូវបានប្រើ។ ពិធីការនេះត្រូវបានធ្វើឱ្យប្រសើរសម្រាប់ DNA ជាមួយនឹងតម្លៃសមាមាត្រស្រូបយក 1.8 ។ ប្រសិនបើមាន RNA លើសនៅក្នុង DNA sampដូច្នេះ វាគួរតែត្រូវបានយកចេញជាមួយនឹងការព្យាបាល RNase ។
កំពុងរង់ចាំប៉ាតង់។
4 100032-USG V5.0

មាតិកាឧបករណ៍

កញ្ចប់រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ទំហំស្តង់ដារ (ប្រអប់ 2) ប្រអប់ទី 1 នៃ 2៖ ប្រអប់ផ្ទុកសារធាតុបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM 1 V1 (PN 100035)

ចំណាំ៖ មិនត្រូវបង្កក និងរលាយសារធាតុ 1 ប្រអប់លើសពី 6 ដង។

ឈ្មោះសមាសធាតុ

ពណ៌មួក

កម្រិតសំឡេង (អិល)

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក

5 × សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម

CAP ខៀវ

120

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

អង់ស៊ីម Barcoding

CAP ខ្មៅ

24

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

កូហ្វាកទ័រ II

CAP Amber

120

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

Exonuclease

CAP ពណ៌លឿង

12

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

ឧបករណ៍ទប់លំនឹង

CAP Violet

12

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

Suspension Buffer EZ

CAP ធម្មជាតិ

180

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

Tagអង់ស៊ីម ging

CAP ក្រហម

24

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

2 × PCR Master Mix

CAP ពណ៌ផ្កាឈូក

150

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

Enhancer 10 × Primer Ia

CAP បៃតង

18

CAP ពណ៌ស

30

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C -25 ° C ទៅ -15 ° C

a សម្រាប់ប្រើជាមួយ 10× Primer II នៅក្នុង TELL-SeqTM Library Multiplex Primer Kit រួមគ្នាសម្រាប់បណ្ណាល័យ ampការធ្វើត្រាប់តាម។

ប្រអប់ទី 2 នៃ 2៖ TELL-SeqTM Library Reagent Box 2 V1 (PN 100036)

ឈ្មោះសមាសធាតុ

ពណ៌មួក

កម្រិតសំឡេង (អិល)

ប្រាប់ Bead Plexb

CAP ពណ៌ទឹកក្រូច

76

លាងសមាតដំណោះស្រាយ

CAP ពណ៌ស

4500

បញ្ឈប់ដំណោះស្រាយ

CAP ធម្មជាតិ

960

b TELL Bead Plex ដំណើរការបានល្អទាំងលើប្រព័ន្ធ Illumina និងមិនមែន Illumina Sequencing Systems។

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក 2°C ទៅ 8°C 2°C ទៅ 8°C 2°C ទៅ 25°C

c មុនពេលប្រើ ប្រសិនបើដំណោះស្រាយបញ្ឈប់មិនច្បាស់ ឬមានទឹកភ្លៀងពណ៌ស សូមកំដៅបំពង់ឡើងនៅសីតុណ្ហភាព 37C។ Vortex ដើម្បីរំលាយទឹកភ្លៀងណាមួយ។ បន្ទាប់ពីការប្រើប្រាស់លើកដំបូង សូមទុកដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ដែលបានផ្អាកឡើងវិញនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់សម្រាប់ការប្រើប្រាស់នាពេលអនាគត។

ប្រយ័ត្ន
TELL-Read pipeline v1.1 ឬខ្ពស់ជាងនេះ គឺតម្រូវឱ្យធ្វើការវិភាគទិន្នន័យលំដាប់លំដោយដែលបង្កើតចេញពីបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ដែលរៀបចំជាមួយ TELL Bead Plex។

5 100032-USG V5.0

TELL-SeqTM Library Prep Kit, HT24 (ប្រអប់ 2) ប្រអប់ 1 នៃ 2៖ ប្រអប់ផ្ទុកសារធាតុ Reagent បណ្ណាល័យ TELL-SeqTM 1 V1, HT24 (PN 100037)
ចំណាំ៖ មិនត្រូវបង្កក និងរលាយសារធាតុ 1 ប្រអប់លើសពី 6 ដង។

ឈ្មោះសមាសធាតុ

ពណ៌មួក

កម្រិតសំឡេង (អិល)

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក

5 × សតិបណ្ដោះអាសន្នប្រតិកម្ម

CAP ខៀវ

720

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

អង់ស៊ីម Barcoding

CAP ខ្មៅ

144

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

កូហ្វាកទ័រ II

CAP Amber

720

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

Exonuclease

CAP ពណ៌លឿង

72

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

ឧបករណ៍ទប់លំនឹង

CAP Violet

72

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

Suspension Buffer EZ

CAP ធម្មជាតិ

1080

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

Tagអង់ស៊ីម ging

CAP ក្រហម

144

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

2 × PCR Master Mix

CAP ពណ៌ផ្កាឈូក

900

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

Enhancer 10 × Primer Ia

CAP បៃតង

108

CAP ពណ៌ស

180

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C -25 ° C ទៅ -15 ° C

a សម្រាប់ប្រើជាមួយ 10× Primer II នៅក្នុង TELL-SeqTM Library Multiplex Primer Kit រួមគ្នាសម្រាប់បណ្ណាល័យ ampការធ្វើត្រាប់តាម។

ប្រអប់ទី 2 នៃ 2៖ TELL-SeqTM Library Reagent Box 2 V1, HT24 (PN 100038)

ឈ្មោះសមាសធាតុ

ពណ៌មួក

កម្រិតសំឡេង

ប្រាប់ Bead Plexb

CAP ពណ៌ទឹកក្រូច

456 អិល

លាងសមាតដំណោះស្រាយ

CAP ខៀវ

28.5 មីលីលីត្រ

បញ្ឈប់ដំណោះស្រាយ

CAP ពណ៌ស

5.76 មីលីលីត្រ

b TELL Bead Plex ដំណើរការបានល្អទាំងលើប្រព័ន្ធ Illumina និងមិនមែន Illumina Sequencing Systems។

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក 2°C ទៅ 8°C 2°C ទៅ 8°C 2°C ទៅ 25°C

c មុនពេលប្រើ ប្រសិនបើដំណោះស្រាយបញ្ឈប់មិនច្បាស់ ឬមានទឹកភ្លៀងពណ៌ស សូមកំដៅបំពង់ឡើងនៅសីតុណ្ហភាព 37C។ Vortex ដើម្បីរំលាយទឹកភ្លៀងណាមួយ។ បន្ទាប់ពីការប្រើប្រាស់លើកដំបូង សូមទុកដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ដែលបានផ្អាកឡើងវិញនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់សម្រាប់ការប្រើប្រាស់នាពេលអនាគត។

PRO TIP៖ ឧបករណ៍រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ពីរ, HT24 រួមទាំងប្រអប់ទី 1 និងប្រអប់ទី 2 អាចផ្គូផ្គងជាមួយឧបករណ៍ TELL-SeqTM Library Multiplex Primer ណាមួយ។

ប្រយ័ត្ន
TELL-Read pipeline v1.1 ឬខ្ពស់ជាងនេះ គឺតម្រូវឱ្យធ្វើការវិភាគទិន្នន័យលំដាប់លំដោយដែលបង្កើតចេញពីបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ដែលរៀបចំជាមួយ TELL Bead Plex។
TELL-SeqTM Library Multiplex Primer (1-8) Kit (PN 100003)

ឈ្មោះសមាសធាតុ 10× Primer II, T501 10× Primer II, T502 10× Primer II, T503 10× Primer II, T504

Cap Color CAP Blue CAP Black CAP Green CAP លឿង

បរិមាណ (L) 15 15 15 15

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក -25°C ទៅ -15°C -25°C to -15°C -25°C to -15°C -25°C to -15°C

6 100032-USG V5.0

10 × Primer II, T505 10 × Primer II, T506

CAP Violet CAP Natural

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T507

CAP ក្រហម

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T508

CAP ពណ៌ទឹកក្រូច

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

PRO TIP: មួយ TELL-SeqTM Library Multiplex Primer (1-8) មាន primer គ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ប្រើជាមួយ FOUR TELL-SeqTM WGS Library Prep Kits ។

TELL-SeqTM Library Multiplex Primer (9-16) Kit (PN 100009)

ឈ្មោះសមាសធាតុ

ពណ៌មួក

កម្រិតសំឡេង (អិល)

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក

10 × Primer II, T509

CAP ខៀវ

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T510 10 × Primer II, T511

CAP Amber CAP បៃតង

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T512

CAP ពណ៌លឿង

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T513 10 × Primer II, T514

CAP Violet CAP ពណ៌ទឹកក្រូច

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T515

CAP ក្រហម

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T516

CAP ធម្មជាតិ

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

PRO TIP៖ ONE TELL-SeqTM Library Multiplex Primer (9-16) Kit មាន primer គ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ប្រើជាមួយ FOUR TELL-SeqTM WGS Library Prep Kits ទំហំស្តង់ដារ។

TELL-SeqTM Library Multiplex Primer (17-24) Kit (PN 100010)

ឈ្មោះសមាសធាតុ

ពណ៌មួក

កម្រិតសំឡេង (អិល)

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក

10 × Primer II, T517

CAP Amber

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T518

CAP ខៀវ

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T519

CAP ពណ៌លឿង

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T520

CAP បៃតង

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T521

CAP ខ្មៅ

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T522

CAP Violet

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T523

CAP ពណ៌ទឹកក្រូច

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

10 × Primer II, T524

CAP ក្រហម

15

ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

PRO TIP៖ ONE TELL-SeqTM Library Multiplex Primer (17-24) Kit មាន primer គ្រប់គ្រាន់សម្រាប់ប្រើជាមួយ FOUR TELL-SeqTM WGS Library Prep Kits ទំហំស្តង់ដារ។

TELL-SeqTM Illumina® Sequencing Primer Kit (PN 100004)

ឈ្មោះសមាសធាតុ
អាន 1 Primer អាន 2 Primer Index 1 Primer Index 2 Primer

ពណ៌មួក
CAP Black CAP White CAP Red CAP លឿង

ការប្រមូលផ្តុំ
100M 100M 100M 100M

កម្រិតសំឡេង (អិល)
100 100 100 100

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក -25°C ទៅ -15°C -25°C to -15°C -25°C to -15°C -25°C to -15°C

7 100032-USG V5.0

TELL-SeqTM Illumina® Sequencing Primer Kit, HT (PN 100013)

ឈ្មោះសមាសធាតុ
អាន 1 Primer អាន 2 Primer Index 1 Primer Index 2 Primer

ពណ៌មួក
CAP Black CAP White CAP Red CAP លឿង

ការប្រមូលផ្តុំ
100M 100M 100M 100M

កម្រិតសំឡេង (អិល)
600 600 600 600

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក -25°C ទៅ -15°C -25°C to -15°C -25°C to -15°C -25°C to -15°C

TELL-SeqTM Target Blocker (PN 100019)

ឈ្មោះសមាសធាតុ TELL-SeqTM Target Blocker

បរិមាណពណ៌មួក (L)

CAP ពណ៌ស

40

សីតុណ្ហភាពផ្ទុក
ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C

8 100032-USG V5.0

3. សម្ភារៈប្រើប្រាស់ និងបរិក្ខារ (មិនផ្តល់ជូន)

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

ប្រើប្រាស់បាន។

អ្នកផ្គត់ផ្គង់

0.2 mL PCR tube or strip tube 20 L pipette tip ( standard and wide orifice ) 200 L pipette tip ( standard and wide orifice ) Ethanol 200 proof ( absolute ) for molecular biology (500 mL) ទឹកគ្មាននុយក្លេអ៊ែ AMPure XP Agilent Bioanalyzer ឧបករណ៍វិភាគ DNA ភាពរសើបខ្ពស់* TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay*
Qubit dsDNA HS Assay Kit
បំពង់តេស្ត Qubit
Dynabeads MyOne Streptavidin T1
Agilent SureSelect XT HS Capture Library Human All Exon 7 Agilent SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module (Post PCR), 16 Rxn TE buffer, pH 8.0

អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ Sigma-Aldrich, # E7023 អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ Beckman, # A63880 Agilent, # 5067-4626 Agilent, # 5067-5592, #5067-5593 Thermo Fisher Scientific, # Q32851 វិទ្យាសាស្រ្ត, #Q32854 Thermo Fisher Scientific, #32856, 65601 ឬ 65602 Agilent, # G65603N, G9704N ឬ G9705N
Agilent, #G9916B
អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ

*អាស្រ័យលើប្រព័ន្ធណាមួយដែលមាននៅក្នុងកន្លែងអ្នកប្រើប្រាស់។
បរិក្ខារ
បរិក្ខារ

អ្នកផ្គត់ផ្គង់

Thermo Cycler Magnetic stand for 0.2 mL PCR tubes Tube Rotator Incubator (សម្រាប់ 35C) Vortexer Microcentrifuge Agilent Bioanalyzer* Agilent TapeStation*
Qubit® Fluorometer 3.0
Ice Bucket SpeedVac Vacuum Concentrators (ស្រេចចិត្ត)
*អាស្រ័យលើប្រព័ន្ធណាមួយដែលមាននៅក្នុងកន្លែងអ្នកប្រើប្រាស់។

ក្រុមហ៊ុនផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ អ្នកផ្គត់ផ្គង់បន្ទប់ពិសោធន៍ទូទៅ Agilent Agilent Thermo Fisher Scientific, #Q33216, Q33217 ឬ Q33218 អ្នកផ្គត់ផ្គង់មន្ទីរពិសោធន៍ទូទៅ Thermo Fisher Scientific

9 100032-USG V5.0

4. TELL-SeqTM Human Exome Capture Workflow
10 100032-USG V5.0

5. ពិធីការ

A. TELL-SeqTM WGS Library Prep

ពិធីការខាងក្រោមពិពណ៌នាអំពីនីតិវិធីរៀបចំបណ្ណាល័យតាមលំដាប់ហ្សែនទាំងមូល TELL-SeqTM ដែលបានកែប្រែជាមួយនឹងឧបករណ៍រៀបចំបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ដោយប្រើ DNA របស់មនុស្ស។amples ។ DNA ហ្សែនខុសគ្នាampប្រភេទ le ក៏អាចត្រូវបានជំនួសដោយធ្វើតាមពិធីការដូចគ្នា។ បណ្ណាល័យ TELL-SeqTM អាចប្រើបានជាមួយប្រព័ន្ធ Target Enrichment ផ្សេងទៀត ប៉ុន្តែ Agilent SureSelectXT HS Target Enrichment System ដោយប្រើ SureSelect Human All Exon V8 capture probes ត្រូវបានប្រើជាអតីតample ក្នុងពិធីការ។ សម្រាប់ការប្រើប្រាស់នៅក្នុងប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅផ្សេងទៀត សូមអនុវត្តតាមពិធីការសម្រាប់ TELL-SeqTM Library Prep (ទំព័រ 10-22) ដើម្បីបង្កើតបណ្ណាល័យសមស្រប។ បណ្ណាល័យ TELL-SeqTM អាចត្រូវបានប្រើជាការបញ្ចូល DNA តាមពិធីការនៃប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅជាក់លាក់នីមួយៗ រួមជាមួយនឹងឧបករណ៍ទប់ស្កាត់គោលដៅ TELL-SeqTM ដែលត្រូវបានប្រើបន្ថែមលើឧបករណ៍ទប់ស្កាត់ដែលបានបញ្ជាក់។
បាកូដ DNA

I.

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

បញ្ចូល DNA ហ្សែន (អ្នកប្រើប្រាស់)

ទំហំហ្សែនធំ (មនុស្ស)

បរិមាណបញ្ចូល 5 ng

ប្រតិកម្ម Vol (L) Preps/Kit

150

4

ចំណាំ៖
1. DNA ហ្សែនគួរតែត្រូវបានរក្សាទុក និងពនឺក្នុងសតិបណ្ដោះអាសន្ន Tris ដែលមាន pH ចាប់ពី 7.5 ដល់ 8.0 ឬសតិបណ្ដោះអាសន្ន TE ទាប (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0)។
5× Reaction Buffer (Kit Box 1, CAP Blue) Cofactor II (Kit Box 1, CAP Amber) Barcoding Enzyme (Kit Box 1, CAP Black) TELL Bead or TELL Bead Plex (Kit Box 2, CAP Orange) Suspension Buffer EZ (Kit Box 1, CAP) ទឹកគ្មានជាតិគីមី 0.2. ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់) 20 L និង 200 L គន្លឹះបំពង់បង្ហូរតាមច្រកទ្វារ (អ្នកប្រើប្រាស់)

11 100032-USG V5.0

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ 5 × Reaction Buffer CAP
Cofactor II CAP
អង់ស៊ីម Barcoding CAP TELL Bead Plex CAP Suspension Buffer EZ CAP ទឹកគ្មាននុយក្លេអែ

ការផ្ទុក -25 ° C ទៅ -15 ° C
ពី -25 ° C ទៅ -15 ° C
ពី -25°C ទៅ -15°C 2°C ទៅ 8°C
សីតុណ្ហភាពបន្ទប់ -25°C ដល់ -15°C

ការណែនាំ
រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ ទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ក្នុងទីងងឹត។ បិទគម្របបំពង់ឱ្យតឹង បន្ទាប់ពីការប្រើប្រាស់នីមួយៗ។ ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយ។ Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។ Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។ បិទ​គម្រប​បំពង់​ឱ្យ​តឹង​បន្ទាប់​ពី​ប្រើ​ម្តងៗ ដើម្បី​ជៀសវាង​ការ​ហួត​។
រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

2. ដំឡើងឧបករណ៍បង្វិលបំពង់នៅក្នុង incubator 35C (សូមមើលជំហានទី 7 នៃផ្នែកនីតិវិធី) ។
ការប្រុងប្រយ័ត្ន ប្រើគន្លឹះបំពង់បង្ហូរចេញធំទូលាយដើម្បីផ្ទេរ និងលាយ DNA ហ្សែនដែលមានទម្ងន់ម៉ូលេគុលខ្ពស់ ដើម្បីជៀសវាងការបំបែក DNA ។ ប្រសិនបើគន្លឹះបំពង់បង្ហូរចេញធំទូលាយមិនមានទេ សូមកាត់ 2mm-3mm ចេញពីកំពូលបំពង់ទុយោស្ដង់ដារដោយកាំបិតឡាមស្អាតមុនពេលប្រើ។
III. នីតិវិធី 1. Vortex TELL Bead Plex យ៉ាងខ្លាំងក្លាយ៉ាងហោចណាស់ 30 វិនាទី។ Pulse spin (centrifuge មិនលើសពី 1 វិនាទី) ដើម្បីទម្លាក់សូលុយស្យុងអង្កាំដែលមាននៅលើគម្រប ឬផ្នែកម្ខាងនៃបំពង់។ មុនពេលប្រើ សូមដាក់បំពង់ TELL Bead Plex ដោយប្រើម្ជុល 200 L ឡើងលើ និងចុះក្រោម 5 ដង ដើម្បីប្រាកដថា អង្កាំទាំងអស់ត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។ 2. នៅក្នុងបំពង់ PCR 0.2 mL ប្រមូលផ្តុំប្រតិកម្មនីមួយៗតាមលំដាប់ដូចខាងក្រោម។

សារធាតុប្រតិកម្ម
5 × Reaction Buffer CAP ទឹកគ្មាននុយក្លេអែរ Cofactor II CAP TELL Bead Plex CAP (0.5M barcodes/L)

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L)
ហ្សែនធំ (150 អិល)
30 20 Z (Z គឺជាវ៉ុល DNA)
៦៧ ៨

12 100032-USG V5.0

3. លាយល្អដោយដាក់បំពង់ឡើងលើ និងចុះក្រោម 10 ដង ឬ vortexing យ៉ាងខ្លាំងក្លារយៈពេល 5 វិនាទី ហើយជីពចរបង្វិលដើម្បីនាំយកដំណោះស្រាយចុះក្រោម។ បន្ថែមអង់ស៊ីម Barcoding ។

សារធាតុប្រតិកម្ម

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L) ហ្សែនធំ

បាកូដអង់ស៊ីម CAP

6 អិល

៤- លាយ​ឱ្យ​សព្វ​ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​ចំនួន ៨ ដង។ ជៀសវាងការណែនាំពពុះខ្យល់នៅពេលដាក់បំពង់ ដោយទុកចុងបំពង់នៅផ្នែកខាងក្រោមនៃដំណោះស្រាយនៅក្នុងបំពង់។
5. ប្រើចុងបំពង់ទុយោធំទូលាយ បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោម។

សារធាតុប្រតិកម្ម
Sample genomic DNA Suspension Buffer EZ CAP

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L)
ហ្សែនធំ
Z (15) ៤៥

ចំណាំ៖ Suspension Buffer EZ មាន viscous ខ្លាំង។ ប្រើការប្រុងប្រយ័ត្ន និងដាក់បំពង់យឺតៗ ដើម្បីធានាថាបរិមាណត្រឹមត្រូវត្រូវបានចែកចាយ។

6. កំណត់បរិមាណ pipette នៅ 110 L. ប្រើចុងបំពង់បង្ហូរចេញធំទូលាយ លាយសូលុយស្យុងដោយថ្នមៗ ដោយដាក់បំពង់ឡើងលើចុះក្រោម 6-8 ដង។ ជៀសវាងការដាក់ពពុះខ្យល់ជាច្រើននៅពេលដាក់បំពង់ ដោយទុកចុងបំពង់នៅផ្នែកខាងក្រោមនៃដំណោះស្រាយនៅក្នុងបំពង់។
7. ដាក់ sample tube នៅលើឧបករណ៍បង្វិលបំពង់ក្នុង incubator 35°C ហើយបង្វិលយឺតៗ (10-15 rpm) រយៈពេល 30 នាទី។

ចំណាំ៖ ការបង្វិលបំពង់ត្រឹមត្រូវគឺមានសារៈសំខាន់ដើម្បីរក្សាលក្ខណៈសម្បត្តិ HMW DNA និងជួយសម្រួលដល់ដំណើរការសរសេរបាកូដត្រឹមត្រូវ។ ប្រព័ន្ធលាយដែលបានណែនាំត្រូវបានបង្ហាញខាងក្រោម (ផ្នែកខាងឆ្វេង)។ ប្រព័ន្ធលាយដែលមិនបង្វិល ឬដែលបង្កើតការញ័រខ្លាំងគឺមិនឆបគ្នាជាមួយនឹងការរក្សាលក្ខណៈសម្បត្តិ HMW DNA និង TELL-Seq; ប្រព័ន្ធទាំងនេះមួយចំនួនក៏ត្រូវបានបង្ហាញខាងក្រោម (ផ្នែកខាងស្តាំ)។
13 100032-USG V5.0

ធ្វើឱ្យ DNA មានស្ថេរភាព

I. Consumables Stabilizer (ប្រអប់ឧបករណ៍ 1, CAP Violet)

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុរក្សាលំនឹង CAP

ការផ្ទុក -25 ° C ទៅ -15 ° C

ការណែនាំ
ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយ។ Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។

III. នីតិវិធី 1. ទាញយក sampបំពង់ le ពី incubator 35 ° C ។ 2. បន្ថែម Stabilizer ទៅក្នុងបំពង់។

សារធាតុប្រតិកម្ម

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L) ហ្សែនធំ

CAP ស្ថេរភាព

3. កំណត់បរិមាណ pipette នៅ 110 L. ប្រើចុងបំពង់បង្ហូរចេញធំទូលាយ លាយសូលុយស្យុងដោយថ្នមៗ ដោយដាក់បំពង់ឡើងលើចុះក្រោម 6-8 ដង។ ជៀសវាងការបង្កើតពពុះច្រើន។
4. ដាក់ sampបើកបំពង់ត្រឡប់មកវិញនៅលើឧបករណ៍បង្វិលបំពង់នៅក្នុង incubator 35 ° C ហើយបង្វិលវាយឺត (10-15 rpm) សម្រាប់ 30 នាទី។

Tagកំណត់ DNA
IV. សម្ភារៈប្រើប្រាស់ Tagging Enzyme (ប្រអប់កញ្ចប់ទី 1 CAP ក្រហម) Exonuclease (ប្រអប់កញ្ចប់ទី 1 CAP ពណ៌លឿង)
14 100032-USG V5.0

V. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ Tagging Enzyme CAP Exonuclease CAP

ការផ្ទុក -25 ° C ទៅ -15 ° C -25 ° C ទៅ -15 ° C

ការណែនាំ
ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយ។ Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយ។ Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។

2. ប្រើឧបករណ៍បង្វិលបំពង់ដូចគ្នានៅក្នុង incubator 35C ។

VI. នីតិវិធី 1. ទាញយក sampបំពង់ le ពី incubator 35 ° C ។ 2. បន្ថែម Tagging Enzyme និង Exonuclease ចូលទៅក្នុងបំពង់។

សារធាតុប្រតិកម្ម

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L) ហ្សែនធំ

TagGing Enzyme CAP

2

Exonuclease CAP

3

3. កំណត់បរិមាណ pipette នៅ 110 L. ប្រើចុងបំពង់បង្ហូរចេញធំទូលាយ លាយសូលុយស្យុងដោយថ្នមៗ ដោយដាក់បំពង់ឡើងលើចុះក្រោម 8 ដង។ សម្រាប់ជំហាននេះការលាយត្រូវមានភាពហ្មត់ចត់បំផុត។ ជៀសវាងការបង្កើតពពុះច្រើន។
4. ដាក់ sample tube ត្រលប់មកវិញនៅលើឧបករណ៍បង្វិលបំពង់ក្នុង incubator 35°C ហើយបង្វិលវាយឺតៗរយៈពេល 10 នាទី។ នៅពេលចាំបាច់បរិមាណខុសគ្នា Tagging Enzyme អាចត្រូវបានប្រើដើម្បីកែតម្រូវទំហំបណ្ណាល័យ។
ចំណាំ៖ ប្រសិនបើបណ្ណាល័យបញ្ចូលយូរជាងនេះត្រូវបានគេពេញចិត្ត នោះចំនួនតិចជាង Tagging Enzyme អាចត្រូវបានប្រើក្នុងប្រតិកម្ម។ ម្យ៉ាងវិញទៀត ប្រសិនបើបណ្ណាល័យបញ្ចូលខ្លីជាងត្រូវបានគេពេញចិត្ត នោះរហូតដល់ 6µL Tagging Enzymes អាចត្រូវបានប្រើក្នុងប្រតិកម្ម។

5. បន្តទៅជំហានបន្ទាប់ភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការ incubation ។

លាងសមាតអង្កាំ
I. Consumables Stop Solution (ប្រអប់ Kit 2, CAP Natural ឬរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់បន្ទាប់ពីប្រើលើកដំបូង) Wash Solution (Kit Box 2, CAP White) 0.2 mL PCR tube or strip tube (អ្នកប្រើប្រាស់)

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ

ការណែនាំអំពីការផ្ទុក

15 100032-USG V5.0

បញ្ឈប់ដំណោះស្រាយ CAP Wash Solution CAP

ពី 2°C ទៅ 25°C ពី 2°C ទៅ 8°C

ពិនិត្យរកទឹកភ្លៀងណាមួយ។ ប្រសិនបើមានវត្តមាន ចូរភ្ញាស់សតិបណ្ដោះអាសន្ននៅសីតុណ្ហភាព 37°C រយៈពេល 10 នាទី ហើយ vortex រហូតដល់វារលាយ។ រក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់សម្រាប់ការប្រើប្រាស់នាពេលអនាគត។
នាំយកទៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

2. ដំឡើងម៉ាស៊ីនកំដៅជាមួយកម្មវិធីដូចខាងក្រោម៖ · ជម្រើសគម្របកំដៅមុនដល់ 100°C · 63°C ជារៀងរហូត
III. នីតិវិធី

1. ដាក់ sample tube នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។ 2. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នាចង់បាន ហើយបោះចោលវត្ថុដែលលើសដោយគ្មាន
អង្កាំរំខាន។ 3. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់មេដែក។ បន្ថែមដំណោះស្រាយលាងសម្អាត 120 លីត្រទៅ sampបំពង់។
បំពង់ដើម្បីព្យួរអង្កាំ។ បើចាំបាច់ ជីពចរបង្វិលដើម្បីយកដំណោះស្រាយចុះ។ 4. ដាក់ sample tube ត្រលប់មកវិញនៅលើជំហរម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។ 5. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នាចង់បាន ហើយបោះចោលអតិផរណាដោយគ្មាន
អង្កាំរំខាន។ 6. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់មេដែក។ បន្ថែម 80 លីត្រនៃដំណោះស្រាយបញ្ឈប់ទៅបំពង់។ 7. Pipet ជាច្រើនដងដើម្បីផ្អាកអង្កាំ។ បើចាំបាច់ជីពចរបង្វិលដើម្បីនាំយកដំណោះស្រាយ
ចុះ។ 8. ដាក់បំពង់នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 5 នាទី។ 9. ដាក់ sample tube ត្រលប់មកវិញនៅលើជំហរម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។ 10. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នាចង់បាន ហើយបោះចោលអតិផរណាដោយគ្មាន
អង្កាំរំខាន។ 11. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់មេដែក។ បន្ថែមដំណោះស្រាយលាងសម្អាត 120 លីត្រទៅក្នុងបំពង់ PCR ។ បំពង់
ដើម្បីផ្អាកអង្កាំឡើងវិញ។ 12. ផ្ទេរដំណោះស្រាយអង្កាំទាំងអស់ទៅក្នុងបំពង់ PCR ថ្មី 0.2ml ។ 13. ដាក់បំពង់នៅសីតុណ្ហភាព 63C នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ PCR រយៈពេល 3 នាទី។ 14. ដាក់ s ថ្មី។ample បំពង់នៅលើម៉ាញេទិកឈរនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់រយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់
ដំណោះស្រាយគឺច្បាស់។ 15. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ប្រាថ្នា ហើយបោះចោលវត្ថុដែលលើសដោយគ្មាន
អង្កាំរំខាន។ 16. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់មេដែក។ បន្ថែមដំណោះស្រាយលាងសម្អាត 120 លីត្រទៅក្នុងបំពង់ PCR ។ បំពង់
ដើម្បីផ្អាកអង្កាំឡើងវិញ។ បើចាំបាច់ ជីពចរបង្វិលដើម្បីយកដំណោះស្រាយចុះ។ 17. ដាក់បំពង់នៅសីតុណ្ហភាព 63C នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ PCR រយៈពេល 3 នាទី។ 18. ដាក់ sample បំពង់នៅលើម៉ាញេទិកឈរនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់សម្រាប់ 1 នាទីឬរហូតដល់
ដំណោះស្រាយគឺច្បាស់។ 19. ខណៈពេលដែលបំពង់គឺនៅលើជំហរម៉ាញេទិក, aspirate និងបោះបង់ supernatant ដោយគ្មាន
អង្កាំរំខាន។ ប្រើបំពង់ P20 ដើម្បីលុបអតិសុខុមប្រាណដែលនៅសេសសល់។ 20. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់មេដែក។ ផ្អាកអង្កាំម្តងទៀតក្នុង 20 លីត្រនៃដំណោះស្រាយលាង។

16 100032-USG V5.0

ចំណាំ៖ នេះគឺជាចំណុចឈប់ដោយសុវត្ថិភាព។ អង្កាំដែលលាងសម្អាតអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព 2°C ទៅ 8°C រយៈពេលពីរសប្តាហ៍។

Amplify បណ្ណាល័យ

I.

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

2× PCR Master Mix (ប្រអប់ Kit 1, CAP Pink)

10× Primer I (ប្រអប់ឈុត 1, CAP White)

10 × Primer II, T50# (កញ្ចប់ថ្នាំ primer ច្រើន)

ទឹកគ្មានជាតិគីមី (អ្នកប្រើប្រាស់)

0.2 mL បំពង់ PCR ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់)

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ 2 × PCR Master Mix CAP 10 × Primer I CAP 10 × Primer II, T50# Enhancer CAP Green ទឹកដែលមិនមាននុយក្លេអ៊ែរ

កន្លែងផ្ទុក -25°C ទៅ -15°C -25°C to -15°C -25°C to -15°C -25°C to -15°C សីតុណ្ហភាពបន្ទប់

ការណែនាំ
រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ផ្លុំបំពង់ 4 ទៅ 5 ដងដើម្បីលាយបន្ទាប់មក centrifuge ខ្លី។ បន្តនៅលើទឹកកក។ រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។ រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។ រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

2. រៀបចំបណ្ណាល័យ Ampកម្មវិធី lification (LAP) នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅដូចខាងក្រោម៖ · 63°C 2 នាទី · 72°C 2 នាទី · 98°C 30 វិនាទី · [98°C 15 វិនាទី, 63°C 20 វិនាទី, 72°C 30 វិនាទី] x Cycle Number · 72°C 3 នាទី · 4°C ជារៀងរហូត
ចំណាំ៖
លេខវដ្តអាចបត់បែនបានដោយផ្អែកលើកម្មវិធី និងតម្រូវការ។ សូមផ្តល់អនុសាសន៍ចាប់ផ្តើមជាមួយនឹង 13 វដ្ត។ លេខវដ្តខ្ពស់នឹងបង្កើតបណ្ណាល័យ TELL-Seq បន្ថែមទៀតដែលជាធាតុបញ្ចូលសម្រាប់ Hybridization និង Capture ប៉ុន្តែអត្រាស្ទួនខ្ពស់ជាងសម្រាប់ការវិភាគលំដាប់ចុងក្រោយ។ ចំនួនវដ្តទាបអាចបន្ថយអត្រាចម្លង ប៉ុន្តែការបញ្ចូល DNA ទាបអាចបណ្តាលឱ្យថយចុះប្រសិទ្ធភាពនៃការចាប់យក និងកាត់បន្ថយភាពស្មុគស្មាញបណ្ណាល័យ។ សូមយោងទៅចុងបញ្ចប់នៃ Qualify and Quantify Library for Hybridization and Capture សម្រាប់ការពិចារណាបន្ថែមនៅពេលកំណត់ចំនួនវដ្តសមស្រប។

17 100032-USG V5.0

ទំហំហ្សែនធំ

Vol of Beads Used (B) សម្រាប់ PCR 20 L

PCR បរិមាណ 75 អិល

លេខវដ្ត 12-14

III. នីតិវិធី 1. អង្កាំ Vortex យ៉ាងខ្លាំងក្លារយៈពេល 10 វិនាទី ដើម្បីផ្អាកអង្កាំឡើងវិញ។ ជីពចរបង្វិលដើម្បីនាំយកដំណោះស្រាយចុះក្រោម។ ដោយប្រើគន្លឹះ 20 លីត្រ បូមអង្កាំឡើងលើ និងចុះក្រោម 5 ដង ដើម្បីប្រាកដថា អង្កាំទាំងអស់ត្រូវបានផ្អាកឡើងវិញបានត្រឹមត្រូវ។ ផ្ទេរបរិមាណសូលុយស្យុងអង្កាំទាំងមូលទៅបំពង់ PCR ថ្មី។ 2. ដាក់បំពង់ PCR នៅលើម៉ាញេទិករយៈពេល 1 នាទី ឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។ 3. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក យក 20 L supernatant ចេញដោយគ្មានអង្កាំរំខាន។ ដកបំពង់ PCR ចេញពីមេដែក។ 4. បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោមទៅបំពង់ PCR ។

សារធាតុប្រតិកម្ម
ទឹកគ្មានជាតិនុយក្លេអ៊ែរ 2 × PCR Master Mix CAP 10 × Primer I CAP 10 × Primer II, T50# Enhancer CAP Green

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L)
ហ្សែនធំ (75 អិល) 16 លី 37.5 លី 7.5 លី 7.5 លី 4.5 អិល

5. លាយល្អដោយ vortexing ឬ pipetting ។ ជីពចរបង្វិលដើម្បីនាំយកដំណោះស្រាយចុះក្រោម។ 6. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ ហើយដំណើរការកម្មវិធី LAP (សូមមើលខាងលើ) ដោយត្រឹមត្រូវ។
ចំនួននៃវដ្ត។ 7. បន្ទាប់ពី PCR amplification ប្រើផលិតផល 2 L PCR សម្រាប់ការត្រួតពិនិត្យគុណភាពនៅលើ Bioanalyzer ឬ a
ស្ថានីយទូរទស្សន៍ សូមមើលផ្នែក Qualify and Quantify Library សម្រាប់ការណែនាំ។
ជំនួយណែនាំ៖ ប្រសិនបើការពិនិត្យ QC បង្ហាញថាទិន្នផលបណ្ណាល័យមានកម្រិតទាប សូមដាក់បំពង់ជាមួយនឹងផលិតផល PCR ដែលនៅសេសសល់ត្រឡប់ទៅម៉ាស៊ីនកម្តៅ និង ampកំណត់សម្រាប់វដ្តបន្ថែមមួយ ឬពីរផ្សេងទៀត មុនពេលផ្លាស់ទីទៅផ្នែកសម្អាតបណ្ណាល័យ។

ចំណាំ៖ នេះគឺជាចំណុចឈប់ដោយសុវត្ថិភាព។ ផលិតផល PCR អាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅ -25 ° C ទៅ -15 ° C សម្រាប់រយៈពេលមួយខែ។

សម្អាតបណ្ណាល័យ
I. សម្ភារៈប្រើប្រាស់ AMPure XP (អ្នកប្រើប្រាស់) 18 100032-USG V5.0

ភស្តុតាងអេតាណុល 200 (ដាច់ខាត) សម្រាប់ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល (អ្នកប្រើប្រាស់) ទឹកគ្មាននុយក្លេអ៊ែ (អ្នកប្រើប្រាស់) បំពង់ PCR 0.2 mL ឬបំពង់ឆ្នូត (អ្នកប្រើប្រាស់)

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុស្រស់ 75% (v/v) អេតាណុល
AMPយូ XP
ទឹកគ្មាននុយក្លេអែរ TE buffer pH 8.0

សីតុណ្ហភាពបន្ទប់ផ្ទុក
ពី 2°C ទៅ 8°C
សីតុណ្ហភាពបន្ទប់ សីតុណ្ហភាពបន្ទប់

ការណែនាំ
ត្រូវការ 400 លីត្រក្នុងមួយវិនាទីampលេ លាយ 1.5 mL អេតាណុល (200 ភស្តុតាង) ជាមួយ 0.5 mL ទឹកគ្មាននុយក្លេអ៊ែ។ Vortex ដើម្បីលាយនិងរក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ យកវាទៅសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់យ៉ាងហោចណាស់ 20 នាទី ហើយកូរឱ្យខ្លាំង ដើម្បីផ្អាកអង្កាំមុនពេលប្រើ។ រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

III. នីតិវិធី 1. សង្ខេប centrifuge sampបំពង់ PCR ដើម្បីនាំយកដំណោះស្រាយទាំងអស់ចុះក្រោម។ 2. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិកឈររយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។ 3. ខណៈពេលដែលបំពង់ស្ថិតនៅលើជំហរម៉ាញេទិក ផ្ទេរ supernatant ទៅបំពង់ PCR ថ្មី 0.2 mL ដោយគ្មានអង្កាំរំខាន។ 4. វាស់បរិមាណនៃ supernatant ដែលបានផ្ទេរ (ផលិតផល PCR) ជាមួយនឹង pipette ។ 5. បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោមទៅក្នុងផលិតផល PCR ទៅក្នុងបរិមាណសរុប 100 លីត្រ។

ផលិតផល PCR Reagent ទឹកគ្មានជាតិគីមី

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម 75 អិល
សរុបទៅ 100 លីត្រចុងក្រោយ

6. Vortex យ៉ាងខ្លាំងក្លាដើម្បីបន្តការ AMPដំណោះស្រាយ ure XP និងបន្ថែម 78 លីត្រ AMPure XP ចូលទៅក្នុងផលិតផល 100 លីត្រ PCR ។
7. លាយដោយបំពង់ឡើងលើចុះក្រោម 10 ដង។ 8. Incubate នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ 5 នាទី។ 9. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិកឈររយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។ 10. ប្រាថ្នា​ហើយ​បោះ​បង់​ចោល​នូវ​ឧត្តមគតិ​ដោយ​គ្មាន​ការ​រំខាន AMPអង្កាំអ៊ុយ។ 11. ខណៈពេលដែលរក្សាបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិក បន្ថែម 200 លីត្រ អេតាណុល 75% ដែលបានរៀបចំថ្មីៗ
ចូលទៅក្នុងបំពង់។ ទុកឱ្យវាអង្គុយរយៈពេល 30 វិនាទី។ 12. ប្រាថ្នា​ហើយ​បោះ​ចោល​អធិប្បាយ​ដោយ​គ្មាន​អង្កាំ​រំខាន។ 13. ធ្វើជំហានទី 11-12 ម្ដងទៀត ដោយរក្សាបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិកទាំងមូល។
ពេលវេលា។ 14. ទុកបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិកដោយបើកគម្រប ហើយទុកឱ្យបំពង់ស្ងួតរយៈពេល 1-2
នាទីដើម្បីហួតដានអេតាណុល។ កុំស្ងួតអង្កាំពេក។ 15. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់ម៉ាញេទិក ហើយបន្ថែមទឹកដែលគ្មានជាតិគីមី 20 លីត្រទៅក្នុងអង្កាំ។ 16. Pipette ឬ vortex ដើម្បីផ្អាកអង្កាំ។ ទុកឱ្យវាអង្គុយរយៈពេល 5 នាទី។ 17. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិកឈររយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។
19 100032-USG V5.0

18. យក 18 L នៃ supernatant ទៅបំពង់ថ្មីមួយ។ ប្រយ័ត្នកុំរំខានអង្កាំ។ 19. supernatant មានបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ។
ចំណាំ៖ នេះគឺជាចំណុចឈប់ដោយសុវត្ថិភាព។ បណ្ណាល័យ TELL-Seq ដែលត្រូវបានបន្សុតអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25°C ដល់ -15°C រយៈពេលមួយខែ។
20 100032-USG V5.0

គុណភាព និងបរិមាណបណ្ណាល័យសម្រាប់ការពង្រឹងគោលដៅ

I.

សម្ភារៈប្រើប្រាស់

Agilent High Sensitivity DNA Kit ឬ TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay

(អ្នកប្រើប្រាស់) Qubit dsDNA HS Assay Kit (អ្នកប្រើប្រាស់) TE buffer, pH 8.0 (អ្នកប្រើប្រាស់)

ចំណាំ៖
ការវិភាគបរិមាណបណ្ណាល័យ qPCR ស្តង់ដារសម្រាប់ប្រព័ន្ធ Illumina ដំណើរការសម្រាប់បណ្ណាល័យ TELL-Seq ប៉ុន្តែវាមិនត្រូវបានទាមទារទេ។

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ចាំបាច់តាមតម្រូវការរបស់ Bioanalyzer ឬ TapeStation និង Qubit ។
III. នីតិវិធី 1. ប្រើប្រាស់បណ្ណាល័យ 1 L សម្រាប់កញ្ចប់ DNA ដែលមានប្រតិកម្មខ្ពស់ ឬបណ្ណាល័យ 2 L សម្រាប់ TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay ។ 2. ពិនិត្យមើលផលិតផល PCR ដែលមិនស្អាតដែលបានរក្សាទុកពី Amplify ផ្នែកបណ្ណាល័យក្នុងពេលតែមួយ។ ផលិតផល PCR ដែលមិនបានសម្អាតអាចមានកម្រិតខ្ពស់នៃ primer dimer និងអាដាប់ទ័រ dimer ។ វាតម្រូវឱ្យមានការពនលាយពីរដងជាមួយនឹងទឹកដែលមិនមានសារធាតុនុយក្លេអ៊ែរ មុនពេលផ្ទុកនៅលើបន្ទះឈីប Bioanalyzer ឬកាសែត TapeStation ដើម្បីជៀសវាងការរំខានដល់សញ្ញាសម្គាល់ទាបជាង។ 3. បណ្ណាល័យដែលមានទំហំល្អគួរមានបំណែកបណ្ណាល័យភាគច្រើនក្រោម 1000 bp (រូបភាពទី 1)។

4. បណ្ណាល័យអាចរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25°C ដល់ -15°C។ 5. បង្កើតបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ដែលពនលាយ 10 ដងample: ពនឺ 2 L នៃបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ជាមួយ 18 L
នៃទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអ៊ែ។ ប្រើបណ្ណាល័យ 4 L diluted ដើម្បីពិនិត្យមើលការផ្តោតអារម្មណ៍ជាមួយ Qubit dsDNA HS Assay Kit ។
21 100032-USG V5.0

6. ប្រើកំហាប់ (ng/L) និងបរិមាណដើម្បីគណនាម៉ាស់សរុបនៃបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM នីមួយៗដែលចូលទៅក្នុងដំណើរការប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅ SureSelectXT HS ។ 500 ng -1,000 ng បណ្ណាល័យ TELLSeqTM ក្នុងមួយវិនាទីample ត្រូវបានណែនាំសម្រាប់លទ្ធផលដ៏ល្អប្រសើរ ប៉ុន្តែការបញ្ចូលក្នុងបណ្ណាល័យមានកម្រិតទាបរហូតដល់ 250 ng ក្នុងមួយវិនាទីample គឺអាចធ្វើទៅបាន ទោះបីជាការអនុវត្តអាចរងផលប៉ះពាល់អវិជ្ជមានក៏ដោយ។ ចំណាំ៖ មានកម្រិតសំឡេងសម្រាប់ពិធីការ Hybridization និង Capture ។ 12 L គឺជាបរិមាណអតិបរមាដែលអនុញ្ញាតសម្រាប់ការបញ្ចូល DNA ។ ការពិចារណាដោយប្រុងប្រយ័ត្នគួរតែត្រូវបានប្រើដើម្បីធានាថាបរិមាណបណ្ណាល័យ DNA ធ្លាក់ក្នុងជួរនេះ។ តាមឧត្ដមគតិប្រើសម្ភារៈបណ្ណាល័យ TELL-Seq ដែលមានទាំងអស់បន្ទាប់ពី QC ចូលទៅក្នុងប្រតិកម្ម Hybridization និង Capture ។
7. (ស្រេចចិត្ត) បណ្ណាល័យ TELL-SeqTM អាចត្រូវបានប្រមូលផ្តុំដោយប្រើ SpeedVac Vacuum Concentrator ។ ប្រសិនបើ SpeedVac នឹងត្រូវបានប្រើសម្រាប់ការប្រមូលផ្តុំបណ្ណាល័យ បណ្ណាល័យ TELL-SeqTM បន្ទាប់ពី AMPការសម្អាត ure XP អាចត្រូវបានដកចេញពីអង្កាំ XP យ៉ាងហោចណាស់ 30 លីត្រទឹកដែលគ្មានសារធាតុ nuclease សម្រាប់ការងើបឡើងវិញកាន់តែប្រសើរ។ បន្ទាប់ពី QC បណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ស្អាតអាចត្រូវបានប្រមូលផ្តុំទៅកម្រិតសំឡេងដែលចង់បានសម្រាប់ Hybridization និង Capture ។ ចំណាំ៖ ប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅផ្សេងទៀតអាចត្រូវបានប្រើដូចជា IDT និង Twist Biosciences ដោយប្រើបណ្ណាល័យ TELLSeqTM ដែលបានបង្កើតឡើង។ អនុវត្តតាមពិធីការពង្រឹងគោលដៅដែលបានបញ្ជាក់ដោយប្រើបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ជាការបញ្ចូល DNA ។ ប្រើ 5ul នៃ TELL-SeqTM TargetSeq Blocker បន្ថែមលើកម្មវិធីទប់ស្កាត់លម្អិតនៅក្នុងពិធីការនីមួយៗ។
22 100032-USG V5.0

B. SureSelect ការពង្រឹងគោលដៅ
ពិធីការខាងក្រោមគឺជាការកែប្រែនៃផ្នែក Hybridization and Capture System SureSelect XT HS Target Enrichment System សម្រាប់ Illumina Paired-End Multiplexed Sequencing Library Protocol (Agilent, G9702-90000)។ ការកែប្រែអនុញ្ញាតឱ្យមានភាពឆបគ្នានៃ TELL-SeqTM WGS Library Prep ជាមួយ Agilent SureSelect XT HS Target Enrichment System និងរាល់ Exon V8 Capture Probes ។ Agilent reagents សម្រាប់គ្រាន់តែ Hybridization និង Capture អាចត្រូវបានទិញដោយឡែកពីគ្នាក្នុងទម្រង់ 16-reaction (Agilent Part Number G9916B)។ ប្រសិនបើប្រើប្រព័ន្ធពង្រឹងគោលដៅផ្សេងទៀត អនុវត្តតាមពិធីការដែលបានបញ្ជាក់សម្រាប់ប្រព័ន្ធនីមួយៗ ហើយជំនួសបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ជាការបញ្ចូល DNA ។ 5ul នៃ TELL-SeqTM Target Blockers ក៏ត្រូវការជាចាំបាច់បន្ថែមលើអ្នកទប់ស្កាត់លម្អិតនៅក្នុងពិធីការបង្កើនប្រសិទ្ធភាពគោលដៅនីមួយៗ

បង្រួបបង្រួមបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ទៅកាន់បន្ទះចាប់យក Exome

I. Consumables SureSelect XT HS និង XT Low Input Blocker Mix, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target
កញ្ចប់ពង្រឹង, ម៉ូឌុល ILM Hyb, ប្រអប់ 2 (Post PCR), CAP Blue) SureSelect RNase Block, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb
ម៉ូឌុល ប្រអប់ 2 (Post PCR), CAP Violet) SureSelect Fast Hybridization Buffer, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit
ILM Hyb Module, Box 2 (Post PCR), Bottle) TELL-SeqTM Target Blocker (UST, TELL-SeqTM Target Blocker Box, CAP White) SSel XT HS និង XT Low Input Human All Exon V7 (Agilent, SSel XT HS និង XT Low Input
Human All Exon V7, CAP Red) ទឹកគ្មានសារធាតុនុយក្លេអ៊ែរ (អ្នកប្រើប្រាស់) 0.2 mL PCR tube ឬ strip tube (អ្នកប្រើប្រាស់) TELL-SeqTM Library (អ្នកប្រើប្រាស់)

បញ្ចូលបរិមាណប្រតិកម្ម Vol (L)

500 -1,000 ng

រហូតដល់ 12 លីត្រ

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ

ការណែនាំអំពីការផ្ទុក

SureSelect XT HS និង XT Low Input Blocker Mix CAP SureSelect RNase Block CAP
SureSelect Fast Hybridization Buffer

-25°C ទៅ -15°C -25°C ទៅ -15°C -25°C ទៅ -15°C

ត្រាំលើទឹកកក។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។ ត្រាំលើទឹកកក។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
រលាយហើយទុកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់

TELL-SeqTM TargetSeq Blocker CAP
TELL-SeqTM DNA Library SSel XT HS និង XT Low Input Human All Exon V8 CAP

-25°C ទៅ -15°C -25°C ទៅ -15°C -85°C ទៅ -75°C

រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
រលាយ​ហើយ​រក្សា​ទុក​នៅ​លើ​ទឹកកក រលាយ​លើ​ទឹកកក។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។

23 100032-USG V5.0

2. រៀបចំកម្មវិធី Hybridization (HP) នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ (ជាមួយគំរបកំដៅ ON) ជាមួយនឹងកម្មវិធីខាងក្រោម។ ចាប់ផ្តើមកម្មវិធី បន្ទាប់មកចុចប៊ូតុងផ្អាកភ្លាមៗ ដោយអនុញ្ញាតឱ្យគម្របកំដៅឡើងដល់សីតុណ្ហភាព ខណៈពេលដែលអ្នករៀបចំប្រតិកម្ម។

លេខ 1 2 3
៦៧ ៨

ចំនួននៃវដ្ត 1 1 1
៦៧ ៨

សីតុណ្ហភាព
១៨០ អង្សាសេ ២០០ អង្សាសេ ១៨០ អង្សាសេ ១៦០ អង្សា ១៦០ អង្សាសេ ២០០ អង្សាសេ ២០០ អង្សាសេ

ពេលវេលា
៥ នាទី ១០ នាទី ១ នាទី ១ នាទី ៣ វិនាទី
កាន់

III. នីតិវិធី 1. ដាក់ 500 ng នៃបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ដែលបានរៀបចំនីមួយៗampចូលទៅក្នុងអណ្តូងបំពង់ឆ្នូត ហើយបន្ទាប់មកនាំយកបរិមាណចុងក្រោយក្នុងអណ្តូងនីមួយៗមក 12 µl ដោយប្រើទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអ៊ែ ប្រសិនបើចាំបាច់។ តាមឧត្ដមគតិធ្វើឱ្យសរុប ampLified TELL-SeqTM បណ្ណាល័យ DNA ក្នុងជួរ 500 ng ហើយប្រើទាំងអស់សម្រាប់ប្រតិកម្មបង្កាត់។ 1000. ទៅបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM នីមួយៗampផងដែរ បន្ថែម 5 µl នៃ SureSelect XT HS និង XT Low Input Blocker Mix ហើយបន្ថែម 5 µl នៃ TELL-SeqTM Target Blocker ។ បិទអណ្តូងបន្ទាប់មក vortex ក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេល 5 វិនាទី។ បង្វិល​បំពង់​ឆ្នូត​ដោយ​ខ្លី​ដើម្បី​ប្រមូល​រាវ​បញ្ចេញ​ពពុះ​។ 3. ផ្ទេរបំពង់ទៅម៉ាស៊ីនកំដៅ ហើយចុចប៊ូតុង Play ដើម្បីបន្តការដំឡើងកម្មវិធី HP ។
ចំណាំ៖
ឧបករណ៍កង់កម្ដៅត្រូវតែផ្អាកក្នុងអំឡុងពេលផ្នែកទី 3 (សូមមើលក្រុមហ៊ុន HP) ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យសារធាតុបន្ថែមត្រូវបានបន្ថែមទៅក្នុងអណ្តូង Hybridization ដូចដែលបានពិពណ៌នាក្នុងជំហានទី 6។ ក្នុងអំឡុងពេលផ្នែកទី 1 និងទី 2 នៃកម្មវិធីជិះកង់កម្ដៅ សូមចាប់ផ្តើមរៀបចំសារធាតុបន្ថែមដូចដែលបានពិពណ៌នានៅក្នុង ជំហានទី 4 និងជំហានទី 5 ។ ប្រសិនបើចាំបាច់ អ្នកអាចបញ្ចប់ជំហានរៀបចំទាំងនេះ បន្ទាប់ពីផ្អាកម៉ាស៊ីនកំដៅក្នុងផ្នែកទី 3 ។

4. រៀបចំដំណោះស្រាយ 25% នៃ SureSelect RNase Block (មាន 1 ភាគនៃ RNase Block ជាមួយនឹងទឹក 3 ភាគ) យោងតាមតារាងខាងក្រោម។ រៀបចំបរិមាណដែលត្រូវការសម្រាប់ចំនួនប្រតិកម្មបង្កាត់ក្នុងការរត់ បូកនឹងលើស។

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L)

សារធាតុប្រតិកម្ម

បរិមាណសម្រាប់ 1 វ៉ុលសម្រាប់ប្រតិកម្ម 8 កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ប្រតិកម្ម 24

ប្រតិកម្ម

(រួមទាំងលើស)

(រួមទាំងលើស)

SureSelect RNase Block CAP

0.5 អិល

4.5 អិល

12.5 អិល

ទឹកគ្មានជាតិគីមី

1.5 អិល

13.5 អិល

37.5 អិល

5. រៀបចំ Capture Library Hybridization Mix តាមលំដាប់ដូចខាងក្រោម។

សារធាតុប្រតិកម្ម

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L)

24 100032-USG V5.0

កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 1 ប្រតិកម្ម

ដំណោះស្រាយប្លុក RNase 25%

2 អិល

SSel XT HS និង XT Low Input Human ទាំងអស់ Exon V7 CAP

5 អិល

SureSelect Fast Hybridization Buffer

6 អិល

កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 8 ប្រតិកម្ម (រួមបញ្ចូល
លើស) 18 លីត្រ
45 អិល
54 អិល

កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 24 ប្រតិកម្ម (រួមបញ្ចូល
លើស) 50 លីត្រ
125 អិល
150 អិល

ផ្សំសារធាតុដែលបានរាយបញ្ជីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ លាយល្អដោយ vortexing ក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេល 5 វិនាទីបន្ទាប់មកបង្វិលចុះដោយខ្លី។ បន្តភ្លាមៗទៅជំហានទី 6. 6. នៅពេលដែលម៉ាស៊ីនកំដៅចាប់ផ្តើមផ្នែកទី 3 នៃ HP (1 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 65°C) សូមចុចប៊ូតុងផ្អាក។ ជាមួយនឹងអ្នកជិះកង់បានផ្អាក ហើយខណៈពេលដែលរក្សា DNA + Blocker samples នៅក្នុងអ្នកជិះកង់ ផ្ទេរ 13 µl នៃសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ ថត Hybridization Mix បណ្ណាល័យពីជំហានទី 6 ទៅ s នីមួយៗampលាហើយ លាយ​ឱ្យ​សព្វ​ដោយ​ដាក់​បំពង់​ឡើង​ចុះ​យឺតៗ ៨ ទៅ ១០ ដង។ ពេលនេះអណ្តូងប្រតិកម្មកូនកាត់មានប្រហែល 8 µl 10. សូមប្រាកដថាអណ្តូងទាំងអស់ត្រូវបានបិទជិតទាំងស្រុង។ Vortex ដោយសង្ខេប បន្ទាប់មកបង្វិលបំពង់ឆ្នូតដោយខ្លី ដើម្បីយកពពុះចេញពីបាតអណ្តូង។ ត្រឡប់​បំពង់​ឆ្នូត​ទៅ​ម៉ាស៊ីន​កម្ដៅ​ភ្លាមៗ។ 35. ចុចប៊ូតុង Play ដើម្បីបន្តកម្មវិធីជិះកង់កម្ដៅ ដើម្បីអនុញ្ញាតឱ្យមានការបង្កាត់ DNA s ដែលបានរៀបចំamples ទៅបណ្ណាល័យចាប់យក។

រៀបចំអង្កាំម៉ាញ៉េទិចដែលស្រោបដោយ Streptavidin

I. Consumables Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (អ្នកប្រើប្រាស់) SureSelect Binding Buffer (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module,
ប្រអប់ 1 (Post PCR), CAP)

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ

ការផ្ទុក

Dynabeads MyOne Streptavidin T1

ពី 2°C ទៅ 8°C

SureSelect Binding Buffer, CAP

សីតុណ្ហភាពបន្ទប់

ការណែនាំ
រំញ័រយ៉ាងខ្លាំងក្លា។ រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។
រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

III. នីតិវិធី 1. បញ្ឈប់អង្កាំមេដែក Dynabeads MyOne Streptavidin T1 ឡើងវិញយ៉ាងខ្លាំងក្លានៅលើឧបករណ៍លាយ vortex ។ អង្កាំម៉ាញេទិកដោះស្រាយកំឡុងពេលផ្ទុក។ 2. សម្រាប់កូនកាត់នីមួយៗ sample បន្ថែម 50 µl នៃអង្កាំដែលព្យួរឡើងវិញទៅក្នុងអណ្តូងនៃចាន PCR ស្រស់ ឬបំពង់ឆ្នូត។ 3. លាងសម្អាតអង្កាំដោយបន្ថែម 200 µl នៃ SureSelect Binding Buffer ។ លាយដោយដាក់បំពង់ឡើងលើ និងចុះក្រោម 20 ដង ឬបិទអណ្តូង និង vortex ក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេល 5 វិនាទី។ 10. ដាក់ចានឬបំពង់ឆ្នូតចូលទៅក្នុងឧបករណ៍បំបែកមេដែក។

25 100032-USG V5.0

5. រង់ចាំយ៉ាងហោចណាស់ 5 នាទី ឬរហូតទាល់តែដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់ បន្ទាប់មកយកចេញ ហើយបោះចោលសារធាតុលើស។
6. ធ្វើជំហាន 3-5 ម្តងទៀត 3 ដងទៀតសម្រាប់ការលាងសរុបចំនួន 7 ។ 200. ផ្អាកអង្កាំនៅក្នុង XNUMX µl នៃ SureSelect Binding Buffer ។

ចាប់យក DNA កូនកាត់ដោយប្រើ Streptavidin-coated Beads

I. Consumables SureSelect Wash Buffer 1, 16 Rxn (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit ILM Hyb Module, Box 1 (Post PCR), CAP) SureSelect Wash CAP Buffer 2, 16 Rxn (Agilent, SureSelect Enrichment Box XT HS (ក្រោយ PCR), CAP)
II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ SureSelect Wash Buffer 1, CAP SureSelect Wash Buffer 2, CAP

បន្ទប់ផ្ទុក សីតុណ្ហភាពបន្ទប់

ការណែនាំរក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ កំដៅ 200 μl aliquots នៅ 70 ° C ។ សូមមើលជំហានទី 4

III. និតិវិធី 1. បន្ទាប់ពីជំហានបង្កាត់ត្រូវបានបញ្ចប់ ហើយម៉ាស៊ីនកំដៅឡើងដល់កម្រិត 65°C សូមផ្ទេរ samples ទៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ 2. ផ្ទេរភ្លាមៗនូវបរិមាណទាំងមូល (ប្រហែល 30 µl) នៃល្បាយកូនកាត់នីមួយៗទៅកាន់អណ្តូងដែលមាន 200 µl នៃអង្កាំ streptavidin ដែលត្រូវបានលាងសម្អាតដោយប្រើបំពង់ពហុឆានែល។ Pipette ឡើងចុះ 5 ដងដើម្បីលាយ។ 8. ដាក់បំពង់ឆ្នូតចាប់យកនៅលើឧបករណ៍លាយចាន 3-អណ្តូង ដោយលាយយ៉ាងខ្លាំងក្លា (នៅ 96 rpm) ឬ rotator រយៈពេល 1400 នាទីនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ត្រូវប្រាកដថា សamples ត្រូវបានលាយឱ្យបានត្រឹមត្រូវនៅក្នុងអណ្តូង។ 4. បន្តទៅជំហានបន្ទាប់ភ្លាមៗបន្ទាប់ពីការ incubation ។ ក្នុងអំឡុងពេលនៃការភ្ញាស់រយៈពេល 30 នាទីសម្រាប់ការចាប់យក សូមធ្វើការកក់ទុកជាមុន SureSelect Wash Buffer 2 នៅ 70°C ដូចដែលបានរៀបរាប់ខាងក្រោម។ ដាក់ 200 μl aliquots នៃ Wash Buffer 2 នៅក្នុងអណ្តូងនៃចានអណ្តូង 96 ស្រស់ ឬបំពង់ឆ្នូត។ Aliquot 6 អណ្តូងនៃទ្រនាប់សម្រាប់ DNA នីមួយៗampឡេនៅក្នុងការរត់។ ខ្ទប់អណ្តូង ហើយបន្ទាប់មកដាក់ក្នុងម៉ាស៊ីនកំដៅ ដោយបើកគម្របកំដៅ បើកនៅសីតុណ្ហភាព 70°C រហូតដល់ប្រើក្នុងរយៈពេល 5។ នៅពេលដែលរយៈពេល incubation រយៈពេល 30 នាទីដែលបានផ្តួចផ្តើមក្នុងជំហានទី 3 បានបញ្ចប់ សូមបង្វិល samples ក្នុងរយៈពេលខ្លីដើម្បីប្រមូលរាវ។ 6. ដាក់បំពង់ឆ្នូតនៅក្នុងឧបករណ៍បំបែកមេដែកដើម្បីប្រមូលអង្កាំ។ រង់ចាំ​រហូត​ដល់​ដំណោះ​ស្រាយ​ច្បាស់​លាស់ រួច​យក​ចេញ​ហើយ​បោះចោល​សារធាតុ​ដែល​លើស​។ 7. ផ្អាកអង្កាំម្តងទៀតក្នុង 200 µl នៃ SureSelect Wash Buffer 1. លាយដោយបំពង់ឡើងចុះ 15 ដង រហូតដល់អង្កាំត្រូវបានផ្អាកទាំងស្រុង។ 20. ដាក់បំពង់ឆ្នូតនៅក្នុងឧបករណ៍បំបែកមេដែក។ រង់ចាំដំណោះស្រាយឱ្យច្បាស់ (ប្រហែល 8 នាទី) បន្ទាប់មកយកវាចេញ ហើយបោះចោលកំពូល។ 1. ដកបំពង់ឆ្នូតចេញពីឧបករណ៍បំបែកមេដែក ហើយផ្ទេរទៅ rack នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ ផ្អាកអង្កាំឡើងវិញក្នុង 9 µl នៃ 200°C prewarmed Wash Buffer 70. Pipette up
26 100032-USG V5.0

និងធ្លាក់ចុះ 15 ដងរហូតដល់អង្កាំត្រូវបានផ្អាកទាំងស្រុង។ បិទអណ្តូងជាមួយមួកស្រស់ ហើយបន្ទាប់មក vortex ក្នុងល្បឿនលឿនរយៈពេល 20 វិនាទី។ បង្វិលចាន ឬបំពង់ឆ្នូតដោយសង្ខេប ដើម្បីប្រមូលអង្គធាតុរាវដោយមិនចាំបាច់ចាក់អង្កាំ។ 8. Incubate the samples រយៈពេល 5 នាទីនៅសីតុណ្ហភាព 70 ° C នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅដោយគម្របកំដៅ។ 11. ដាក់បំពង់ឆ្នូតនៅក្នុងឧបករណ៍បំបែកមេដែកនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ រង់ចាំ 1 នាទីដើម្បីឱ្យសូលុយស្យុងជម្រះបន្ទាប់មកយកចេញហើយបោះបង់ចោល supernatant ។ 12. ធ្វើជំហានទី 9-11 ម្តងទៀត 6 ដងទៀត សម្រាប់ការលាងសរុបចំនួន 13 ។ 25. បន្ទាប់ពីផ្ទៀងផ្ទាត់ថា សតិបណ្ដោះអាសន្នលាងសម្អាតទាំងអស់ត្រូវបានដកចេញ សូមបន្ថែមទឹកដែលគ្មាននុយក្លេអ៊ែ XNUMX µl ទៅក្នុងទឹកនីមួយៗ។ampលាហើយ Pipette ឡើងនិងចុះ 8 ដងដើម្បីព្យួរអង្កាំឡើងវិញ។ សamples អាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅលើទឹកកកពីមុន ampការធ្វើត្រាប់តាម
Amplify បណ្ណាល័យចាប់យក

I. Consumables 5 × Herculase II Reaction Buffer (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Clear) Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit), ILM Hyb Module 2P (PCR) ប្រអប់ PCR m (ប្រអប់ក្រហម) dNTP Mix, (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM Hyb Module Box 100 (Post PCR), CAP Green) SureSelect Post-Capture Primer Mix (Agilent, SureSelect XT HS Target Enrichment Kit, ILM
Hyb Module Box 2 (Post PCR), CAP Clear)

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ

ការណែនាំអំពីការផ្ទុក

5 × Herculase II Reaction Buffer CAP Herculase II Fusion DNA Polymerase CAP 100 mM dNTP Mix CAP SureSelect Post-Capture Primer Mix CAP

-25°C ទៅ -15°C -25°C ទៅ -15°C -25°C ទៅ -15°C -25°C ទៅ -15°C

រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
Centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។
រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។ រលាយនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ Vortex ដើម្បីលាយ បន្ទាប់មក centrifuge ដោយសង្ខេប។ បន្តនៅលើទឹកកក។

2. រៀបចំកម្មវិធីខាងក្រោមនៅលើម៉ាស៊ីនកម្តៅទឹកដូចខាងក្រោម៖ · 98°C 2 នាទី · [98°C 30 seconds, 63°C 30 seconds, 72°C 1 នាទី] x 9 · 72°C 5 នាទី · 4°C ជារៀងរហូត

IV. នីតិវិធី 1. រៀបចំបរិមាណសមស្របនៃល្បាយប្រតិកម្ម PCR ។ បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោមទៅបំពង់ PCR ដោយផ្អែកលើចំនួនប្រតិកម្ម។

សារធាតុប្រតិកម្ម

បរិមាណក្នុងមួយប្រតិកម្ម (L)

27 100032-USG V5.0

កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 1 ប្រតិកម្ម

ទឹកគ្មាននុយក្លេអែរ 5 × Herculase II Reaction Buffer CAP Herculase II Fusion DNA Polymerase CAP 100 mM dNTP Mix CAP SureSelect Post-Capture Primer Mix CAP

12.5 L 10 L 1 L 0.5 L 1 អិល

កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 8 ប្រតិកម្ម (រួមបញ្ចូល
លើស)
112.5 L 90 L 9 L 4.5 L 9 អិល

កម្រិតសំឡេងសម្រាប់ 24 ប្រតិកម្ម (រួមបញ្ចូល
លើស)
312.5 L 250 L 25 L 12.5 L 25 អិល

2. រៀបចំបរិមាណសមស្របនៃល្បាយប្រតិកម្ម PCR ។ បន្ថែមសារធាតុប្រតិកម្មខាងក្រោមទៅបំពង់ PCR ដោយផ្អែកលើចំនួនប្រតិកម្ម។ បន្ថែម 25 µl នៃល្បាយប្រតិកម្ម PCR ដែលបានរៀបចំក្នុងតារាងទី 29 ទៅ s នីមួយៗampលេមានផ្ទុក 25 µl នៃ DNA ដែលសំបូរទៅដោយគ្រាប់អង្កាំគោលដៅ (រៀបចំនៅទំព័រទី 26 ហើយទុកនៅលើទឹកកក)។
3. លាយប្រតិកម្ម PCR ឱ្យបានល្អដោយដាក់បំពង់ឡើងលើចុះក្រោមរហូតដល់ការព្យួរអង្កាំមានភាពដូចគ្នា។ ជៀសវាងការបាញ់ទឹក samples នៅលើជញ្ជាំងអណ្តូង; កុំបង្វិល samples នៅជំហាននេះ។
4. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាស៊ីនកំដៅ ហើយដំណើរការកម្មវិធី (សូមមើលខាងលើ) ជាមួយនឹងចំនួនវដ្តត្រឹមត្រូវ។
5. នៅពេលដែល PCR ampកម្មវិធី lification ត្រូវបានបញ្ចប់ បង្វិលបំពង់ឆ្នូតដោយសង្ខេប។ ដោះអង្កាំដែលស្រោបដោយសារធាតុ streptavidin ដោយដាក់ចាន ឬបំពង់ឆ្នូតនៅលើទីតាំងម៉ាញ៉េទិចនៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ រង់ចាំ 2 នាទីដើម្បីឱ្យសូលុយស្យុងជម្រះចេញ បន្ទាប់មកយក supernatant នីមួយៗ (ប្រហែល 50 μl) ទៅកាន់អណ្តូងនៃបំពង់ឆ្នូត។

សម្អាតបណ្ណាល័យដែលចាប់យក

I. សម្ភារៈប្រើប្រាស់ AMPure XP (អ្នកប្រើប្រាស់) Ethanol 200 ភស្តុតាង (ដាច់ខាត) សម្រាប់ជីវវិទ្យាម៉ូលេគុល (អ្នកប្រើប្រាស់) ទឹកគ្មាននុយក្លេអ៊ែ (អ្នកប្រើប្រាស់) TE buffer, pH 8.0 (អ្នកប្រើប្រាស់) 0.2 mL PCR tube ឬ strip tube (អ្នកប្រើប្រាស់)

II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ដូចខាងក្រោមៈ

ធាតុ

ការផ្ទុក

ការណែនាំ

អេតាណុលស្រស់ 75% (v/v) AMPទឹកគ្មានជាតិគីមី ure XP

សីតុណ្ហភាពបន្ទប់ 2°C ទៅ 8°C សីតុណ្ហភាពបន្ទប់

ត្រូវការ 400 លីត្រក្នុងមួយវិនាទីampលេ លាយ 1.5 mL អេតាណុល (200 ភស្តុតាង) ជាមួយ 0.5 mL ទឹកគ្មាននុយក្លេអ៊ែ។ Vortex ដើម្បីលាយនិងរក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។ យកវាទៅសីតុណ្ហភាពក្នុងបន្ទប់យ៉ាងហោចណាស់ 20 នាទី ហើយកូរឱ្យខ្លាំង ដើម្បីផ្អាកអង្កាំមុនពេលប្រើ។ រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

TE buffer, pH 8.0

សីតុណ្ហភាពបន្ទប់រក្សានៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់។

III. និតិវិធី 1. ទម្លាក់សូលុយស្យុងចុះក្រោម ជាមួយនឹងការបង្វិលយ៉ាងលឿន ~1 វិនាទីនៅក្នុង centrifuge ។
28 100032-USG V5.0

2. Vortex យ៉ាងខ្លាំងក្លាដើម្បីបន្តការ AMPដំណោះស្រាយ ure XP និងបន្ថែម 50 លីត្រ AMPure XP ទៅក្នុងផលិតផល PCR នីមួយៗ។
3. លាយដោយបំពង់ឡើងលើចុះក្រោម 10 ដង។ 4. Incubate នៅសីតុណ្ហភាពបន្ទប់ 5 នាទី។ 5. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិកឈររយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។ 6. ប្រាថ្នា​ហើយ​បោះ​បង់​ចោល​នូវ​ឧត្តមគតិ​ដោយ​គ្មាន​ការ​រំខាន AMPអង្កាំអ៊ុយ។ 7. ខណៈពេលដែលរក្សាបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិក បន្ថែម 200 លីត្រ អេតាណុល 75% ដែលបានរៀបចំថ្មីៗ
ចូលទៅក្នុងបំពង់។ ទុកឱ្យវាអង្គុយរយៈពេល 30 វិនាទី។ 8. ប្រាថ្នា​ហើយ​បោះ​ចោល​អធិប្បាយ​ដោយ​គ្មាន​អង្កាំ​រំខាន។ 9. ធ្វើជំហានទី 7-8 ម្ដងទៀត ដោយរក្សាបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិកទាំងមូល។
ពេលវេលា។ 10. ទុកបំពង់នៅលើជំហរម៉ាញេទិកដោយបើកគម្រប ហើយទុកបំពង់ឱ្យស្ងួតរយៈពេល 1-2
នាទីដើម្បីហួតដានអេតាណុល។ កុំស្ងួតអង្កាំពេក។ 11. ដកបំពង់ចេញពីកន្លែងដាក់ម៉ាញេទិក ហើយបន្ថែម 25 L TE buffer ទៅអង្កាំ។ 12. Pipette ឬ vortex ដើម្បីផ្អាកអង្កាំ។ ទុកឱ្យវាអង្គុយរយៈពេល 5 នាទី។ 13. ដាក់បំពង់នៅលើម៉ាញេទិកឈររយៈពេល 1 នាទីឬរហូតដល់ដំណោះស្រាយច្បាស់លាស់។ 14. យក 23 L នៃ supernatant ទៅបំពង់ថ្មីមួយ។ ប្រយ័ត្នកុំរំខានអង្កាំ។ 15. supernatant មានបណ្ណាល័យ TELL-SeqTM ដែលចាប់យក។
ចំណាំ៖
នេះ​ជា​ចំណុច​ឈប់​ដោយ​សុវត្ថិភាព។ បណ្ណាល័យ TELL-Seq ដែលចាប់យកអាចត្រូវបានរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25°C ដល់ -15°C រយៈពេលប្រាំមួយខែ។
មានលក្ខណៈគ្រប់គ្រាន់ និងកំណត់បរិមាណបណ្ណាល័យដែលចាប់យកសម្រាប់លំដាប់លំដោយ
I. Consumables Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit ឬ TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay (អ្នកប្រើប្រាស់)
Qubit dsDNA HS Assay Kit (អ្នកប្រើប្រាស់) TE buffer, pH 8.0 (អ្នកប្រើប្រាស់)
II. ការរៀបចំ 1. រៀបចំសម្ភារៈប្រើប្រាស់ចាំបាច់តាមតម្រូវការរបស់ Bioanalyzer ឬ TapeStation និង Qubit ។
III. នីតិវិធី 1. ប្រើប្រាស់បណ្ណាល័យ 1 L សម្រាប់ Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit ឬ 2 L នៃបណ្ណាល័យសម្រាប់ TapeStation High Sensitivity D5000 ScreenTape Assay ។ 2. ដើម្បីកំណត់កំហាប់បណ្ណាល័យ សូមកំណត់តំបន់នៅលើកម្មវិធីវិភាគ Bioanalyzer ឬ TapeStation ពី 150 bp ទៅ 1000 bp ។ កត់ត្រា សample ការប្រមូលផ្តុំ (nM) សម្រាប់តំបន់នេះ (សូមមើលរូបភាពទី 2) ។ ដើម្បីកំណត់ទំហំបណ្ណាល័យ សូមកំណត់តំបន់ពី 150 bp ទៅ 3000 bp ។ កត់ត្រា សample ទំហំមធ្យម (bp) ជាទំហំបណ្ណាល័យ។
29 100032-USG V5.0

ការប្រុងប្រយ័ត្ន ការអានកំហាប់ពី Bioanalyzer (ឬ TapeStation) គួរតែត្រូវបានប្រើជាចំណុចចាប់ផ្តើមដើម្បីធ្វើឱ្យការរំលាយចាំបាច់ ឬការរួមបញ្ចូលបណ្ណាល័យសម្រាប់លំដាប់។ ផ្ទៀងផ្ទាត់ការប្រមូលផ្តុំនៃបណ្ណាល័យ ឬបណ្តុំបណ្ណាល័យចុងក្រោយដែលរំលាយដោយឧបករណ៍ Qubit dsDNA HS Assay (សូមមើលជំហានទី 6) ។
3. បណ្ណាល័យអាចត្រូវបានបន្តបន្ទាប់គ្នាភ្លាមៗ ឬរក្សាទុកនៅសីតុណ្ហភាព -25°C ដល់ -15°C។ 4. ពេល​ធ្វើ​តាម​លំដាប់​លំដោយ សូម​ពន្យឺត​បណ្ណាល័យ​ដោយ​ប្រើ​សតិបណ្ដោះ​អាសន្ន TE ទៅ​នឹង​កំហាប់​ដែល​បាន​ណែនាំ​ដោយ
ប្រព័ន្ធលំដាប់ Illumina នីមួយៗ។ បង្កើត​បណ្ណាល័យ​ចម្រុះ​សម្រាប់​ការ​បន្តបន្ទាប់​គ្នា​ប្រសិនបើ​បណ្ណាល័យ​ច្រើន​ជាង​មួយ​នឹង​ត្រូវ​បាន​បន្តបន្ទាប់​គ្នា​ក្នុង​ការ​ដំណើរការ​ដូចគ្នា។ 5. វាស់កំហាប់បណ្ណាល័យដោយប្រើ Qubit dsDNA HS Assay Kit ។ ប្រើតម្លៃទំហំមធ្យមពីការវាស់វែង Bioanalyzer (ឬ TapeStation) ជាទំហំបណ្ណាល័យសម្រាប់ការបំប្លែងកំហាប់ម៉ាសទៅជាកំហាប់ molar (nM)។ A = Mass Concentration (ng/µL) S = Library Size (bp) Molar Concentration (nM) = (A*1,000,000)/(S*650) កែតម្រូវកម្រិតសំឡេងដែលត្រូវការក្នុងការរៀបចំលំដាប់លំដោយ ប្រសិនបើកំហាប់បណ្ណាល័យដែលវាស់ដោយ Qubit ខុសពីកំហាប់ដែលបានណែនាំលើសពី 10%។
30 100032-USG V5.0

ឯកសារ/ធនធាន

លំដាប់សកល 100035 ប្រាប់ Seq គោលដៅពង្រឹង [pdf] ការណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់ 100035, 100036, 100037, 100038, 100035 TELL Seq Target Enrichment, 100035, TELL Seq Target Enrichment, Seq Target Enrichment, Target Enrichment

ឯកសារយោង

• សៀវភៅណែនាំអ្នកប្រើប្រាស់